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目的:(1)探讨骨髓间充质干细胞(MSCs)靶向胶质瘤迁移的能力。(2)明确超顺磁性氧化铁纳米粒子(SPIO)体外标记MSCs的适当浓度和不同标记浓度对细胞的生物学活性影响。(3)应用1.5T MRI探讨MSCs靶向颅内胶质瘤迁移的分布模式。(4)探讨单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和基质细胞衍生因子-1a(SDF-1a)在MSCs靶向胶质瘤迁移过程中的作用。方法:(1)分离培养大鼠MSCs,应用增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记MSCs,观察MSCs在体外向胶质瘤细胞迁移的模式,Transwell系统定量分析MSCs的迁移能力。将LacZ标记的MSCs经静脉注入胶质瘤苛瘤大鼠体内,2 w后取下脑、心脏、肺脏、肝脏和肾脏进行X-gal染色观察MSCs在脑胶质瘤苛瘤大鼠的全身分布。(2)体外不同浓度SPIO标记MSCs,观察不同标记浓度细胞活力的改变及标记率,测量并绘制未标记细胞和标记细胞的MTI生长曲线,选取适当浓度标记量。(3)运用SPIO和EGFP双重标记MSCs,静脉移植双标细胞后应用MRI观察MSCs在颅内胶质瘤的时空分布。普鲁士蓝和免疫荧光染色检测MSCs靶向颅内胶质瘤迁移的分布模式。(4)通过RT-PCR及流式细胞仪检测第二代MSCs表达趋化因子受体CCR2和CXCR4的情况:利用Transwell系统探讨趋化因子MCP-1和SDF-1a对MSCs的体外趋化作用;抗体阻断后观察其对MSCs的胶质瘤趋向性的影响。结果:(1)将转染AAV-EGFP的MSCs与F98胶质瘤细胞共同培养后,绿色的MSCs聚集于F98克隆中,而在其它部位均不见绿色MSCs的分布。在不同时间点观察到MSCs在体外向胶质瘤细胞迁移的现象,随着观察时间的延长,更多的绿色MSCs向F98克隆聚集。体外研究显示正常脑组织溶解物或生理盐水不能刺激MSCs和成纤维细胞向其迁移,F98胶质瘤溶解物和F98胶质瘤细胞能显著诱导MSCs向其迁移。单因素方差分析表明不同类型细胞迁移能力存在显著不同(F=22.34;P＜0.001),不同刺激因素诱导MSCs的迁移能力也存在显著的不同(F=7.65;P=0.0002)。MSCs体外迁移能力明显强于成纤维细胞;F98胶质瘤细胞和F98胶质瘤溶解物较其它刺激因素具有更强的趋化作用。MSCs经静脉移植14d后,X-gal染色观察蓝色细胞很少分布于检测器官,而在脑肿瘤中则有大量蓝色的MSCs分布于其中。脑肿瘤内的蓝色MSCs(97.52±16.13/section)显著高于对侧正常脑组织(7.64±2.31/section)和其它器官(心脏:0/section;肺脏:3.76±1.74/section;旰脏:9.64±1.55/section;肾脏:19.78±2.63/section;脾脏:5.74±1.98/section)P<0.001)。(2)体外标记的MSCs普鲁士蓝染色见细胞浆内有许多蓝染的铁颗粒。25μg/ml标记组孵育24h和72h后,台盼蓝染色计数死细胞数约为12%-15%,与未标记细胞(约15%)相比无明显统计学差异。在100μg/ml和250μg/ml标记组孵育24h和72h后,台盼蓝染色计数活细胞数(约57%-78%)明显低于未标记细胞组(约85%)(P＜0.001)。MTT法检测发现SPIO标记MSCs的增殖活力与未标记MSCs相比无改变。1d,3d,1w和2w时测得的OD值比较,两组之间比较无统计学差异。(3)移植7d后,SPIO/EGFP双标细胞侵入肿瘤中,散布于肿瘤内部。14d后,双标细胞不再分布于肿瘤内部,大多数位于肿瘤和正常脑组织之间沿肿瘤边界分布。双标MSCs不仅分布于侵入边缘或肿瘤内部,并能够追踪浸润正常脑组织的肿瘤细胞。1.5 TMRI扫描发现,双标细胞经静脉移植7d后,肿瘤内部呈现一小片界限清晰的低信号暗区,而在移植未标记细胞的对照组则没有信号改变。14d后,在肿瘤的边缘呈现为不连续的弧形低信号。MRI显像所示低信号区与组织切片普鲁士蓝染色相符合。(4)MSCs表达趋化因子受体CCR2和CXCR4;当MCP-1浓度为4、20 ng/ml时,MSCs的迁移数量较对照组有显著性差异(P＜0.01),100、500ng/ml组较对照组无显著性差异。SDF-1a诱导MSCs的趋化作用呈剂量依赖关系,在100 ng/ml浓度时达高峰;抗MCP-1抗体或抗CXCR4抗体显著抑制胶质瘤细胞条件培养基对MSCs的趋化作用。结论:(1)MSCs具有高度特异性地向胶质瘤迁移的能力。(2)SPIO可以简便标记MSCs,并且在适当浓度下对MSCs的生物学活性没有影响。(3)MRI可以实时观察磁性标记MSCs在胶质瘤中的时空分布模式。(4)趋化因子MCP-1和SDF-1a介导MSCs的胶质瘤趋向性。