目的:　　 肺癌是对人类健康危害极大的恶性肿瘤，我国是肺癌发病率较高的地区，尽管目前我国肺癌的发病率有下降趋势，但其发病率和死亡率仍高居恶性肿瘤首位。由于肺癌的发病机制不清，尚不能有效地预防其发生，因此探索肺癌发生的相关机制，寻找特异性的阻断和治疗方法一直是人们努力的方向。　　 最近，大量实验证实存在少量维持恶性生长的并具备自我更新能力的细胞亚群，这群细胞具备较高恶性程度的细胞被称为肿瘤干细胞(cancer stem cell，CSC)或肿瘤起始细胞.目前已经在乳腺癌，肺癌，前列腺癌，结肠癌等多种实体瘤中证实了CSC的存在．因此，根据此学说推测肺癌也可能来源于干细胞，是一种干细胞疾病。传统治疗方法虽然可使肿瘤体积明显缩小，有的甚至可达到完全缓解，但实际上大部分肿瘤经过一段时间的缓解期之后又会复发或转移，这可能是由于现有的治疗手段没有清除这些决定复发和转移的关键细胞——肿瘤干细胞的缘故。　　 侧群细胞(Side population cells，SP)是Goodell在对造血干/祖细胞分离时发现的一群特殊干细胞.由于其细胞膜表面高表达ABC转运蛋白(ATP-binding cassette membrane tranon-sporter，ABC)，可将DNA染料Hoechst33342外排至细胞外，并且具备自我更新、多向分化、成瘤性等一系列干细胞的生物学特征。　　 肺癌细胞对一些化疗药物具有耐药性，且大部分耐药细胞被5-FU阻滞于G0期，而研究表明，肿瘤干细胞大多处于G0期。因此我们猜想，对5-FU表现出耐药性的细胞群中是否可能包含了大量的肿瘤干细胞。我们能否利用这一耐药模型来富集肺癌干细胞?本研究旨在探索5-FU对于肺腺癌细胞系SPC-A1中肿瘤干细胞的影响。　　 方法:　　 1、细胞培养　　 肺腺癌SPC-A1细胞系购自ATCC。SPC-A1细胞在含有10％胎牛血清(GBICOInC.，NY，USA)的RPMI1640培养基(GBICOInc.，NY，USA)和含有10％牛血清(GBICO Inc.，NY，USA)中培养(37℃，5％CO2)。　　 2、四甲基偶氮哩盐(tetrazolium，MTT)法检测细胞增殖能力　　 取对数生长期的肺癌细胞悬液进行细胞计数，分别接种于4个96孔板培养板。接种24小时后加入各种处理因素。处理后第24、48、72、96小时分别加入MTT(5mg/m1)20μl，继续孵育4小时后，每孔加入150μlDMSO溶解结晶，测定各孔吸光度。　　 3、流式细胞仪检测细胞周期　　 收集对数生长期细胞制成1×106个/ml细胞悬液。75％冷乙醇于4℃固定过夜、离心后制成500μL的细胞悬液，加碘化丙啶染液于4℃避光孵育45分钟后上机检测，ModFitLT3.0软件分析细胞周期。　　 4、免疫荧光染色　　 接种细胞于24孔板中，多聚甲醛固定，用0.2％的Triton-X100于常温打孔15-30分钟。1％的BSA常温封闭30分钟。封闭完后加入一抗，4℃过夜。次日，加入相应二抗，室温孵育1个小时后，DAPI染核，荧光显微镜观察。　　 5、Westernblot　　 收集细胞，提取总蛋白，蛋白定量。电泳后将蛋白转印到PVDF膜上，然后用3％小牛血清封闭，一抗4℃孵育过夜，二抗37℃孵育2小时后ECL发光，曝光胶片后，测定灰度值　　 6、FACS分选侧群细胞　　 37℃预热的DMEM培养液（含2％FBS和10mmol/1 HEPES缓冲液）重悬，计数，至细胞密度为1×106/ml;实验分两组：一组先加入Verapamil(50μg/m1)37℃，15min，再加入Hoechst33342荧光染料(5μg/m1)37℃反应90min;另一组直接加入Hoechst33342荧光染料(5μg/m1)37℃反应90min，洗涤并重悬，PI(2μg/ml)染死亡细胞；紫外光源流式细胞仪进行检测及分选。　　 7、Transwell基质胶细胞侵袭试验　　 用无血清的培养基将Matrigel加入到孔径为8.0μm的Tranwell小室中，向小室的上室中加入100μl的细胞悬液(5×105cells/ml)，下室中加入含10％FBS的血清作为趋化诱导剂，孵箱中孵育36小时后取出，用无菌的棉签擦拭去上室的胶，滤膜经固定、染色后封片，镜检10个高倍视野(400×)。　　 8、克隆形成能力实验　　 将刚刚分选所得的SP和non-SP细胞分别接种于六孔扳，培养一周左右进行结晶紫染色计数形成的克隆数（见图）。克隆形成率(CloneFormation Efficiency，CFE)的计算公式为：CFE=克隆形成数／接种细胞数×100％。　　 9、裸鼠致瘤实验　　 从SPC-A1细胞系中分选出的SP和non-SP细胞分别用RPMI.1640完全培养液重悬，计数，调整细胞浓度至5×104/ml，每个浓度接种3只BALB/c免疫缺陷小鼠，注射后每隔两天观察一次长瘤情况，注射后28天，断颈处死。　　 10、统计分析　　 使用SPSS13.0统计软件进行结果统计。所有以均数土标准差（X±SD）表示的数据，其实验至少重复3次，P值＜0.05具有统计学意义。　　 结果:　　 1、MTT结果提示：5-FU可抑制肺腺癌细胞SPC-A1增殖，不同浓度的5-FU作用于肺癌SPC-A1细胞后，细胞的生长有不同程度的抑制，这种抑制呈时间剂量依赖性，5-FU对肺癌SPC-A1细胞的半数抑制率(IC50)约为100μg/ml。　　 2、细胞周期结果提示：IC50的5-FU作用于肺腺癌细胞系后，S期细胞比例从33.14％减少至18.20％，G0/G1期细胞比例从58.46％增加至76.68％。　　 3、Westem-blot及免疫荧光结果提示：5-FU可增强SPC-A1细胞干细胞标记物的表达，在正常的肺腺癌SPC-A1细胞中Oct3/4，Sox2和ABCG2几乎不表达，在5-FU半数抑制率(IC50)约为100μg/ml作用24h，48h后，SPC-A1中Oct3/4，Sox2和ABCG2表达逐渐增强，三者表达趋势接近一致。　　 4、FACS结果提示：贴壁生长的SPC-A1细胞其SP细胞比例约为1.32％，5-FU分别作用24h，48h后，SP细胞比例显著升高，分别达4.8％，8.0％。　　 5、Transwell结果提示：SP细胞穿过基底膜的平均细胞数(60.75)远远多于转染non-SP细胞(20.13)，这提示SP细胞具备较强侵袭能力，具备肿瘤干细胞特性。SP细胞相对non-SP细胞具备较强侵袭能力。　　 6、克隆形成能力计算所得SP细胞的CFE为40±2.3％，而non-SP细胞的CFE仅为14±1.2％，二者差异显著(P＜0.05）。　　 7、裸鼠致瘤实验提示：SP细胞及non-SP细胞的致瘤能力存在显著差异。相同数量的SP细胞在同一观察时间点可以形成更大的肿瘤，且形成肿瘤的潜伏期较短。移植瘤组织经石蜡包埋切片，HE染色检查证实为腺癌。　　 结论:　　 1、5-FU作用于肺腺癌细胞SPC-A1，干细胞标记物Oct3/4，Sox2表达增强，侧群细胞比例增加　　 2、5-FU不能有效杀灭肺腺癌细胞SPC-A1中的肿瘤干细胞，反而起到富集作用