Mad2(有丝分裂阻滞缺陷蛋白2)是纺锤体检查点(SAC)的关键蛋白,在生理条件下存在两种不同的构象:有潜在活性的O-Mad2和有活性的C-Mad2,且处于动态平衡。Mad2构象间的转变以及Mad2与其配体Cdc20(细胞分裂周期蛋白20)间的相互作用对SAC发挥其生物学功能至关重要,是目前Mad2功能研究的热点。研究发现Mad2在肿瘤的发生、发展中扮演着重要的角色,已成为肿瘤治疗的重要靶点。然而,关于Mad2两种不同构象间的转变及Mad2与Cdc20间相互作用的机理仍不清楚。因此,为了进一步探究Mad2构象转变的机理及Mad2与Cdc20相互作用的过程,本文以野生型Mad2为模板,构建了Mad2的7个双定点突变体,进行荧光双标记后利用单分子荧光共振能量转移技术(sm-FRET)来研究Mad2的折叠/解折叠动力学过程以及Mad2与Cdc20间相互作用过程中Mad2本身的构象变化过程,本研究为进一步揭示两者相互作用的机理提供了实验依据。主要内容如下:(1)本论文以野生型Mad2为模板,成功构建了Mad2的7个双定点突变体。利用大肠杆菌表达系统制备Mad2突变体蛋白,经阴离子交换色谱柱纯化出Mad2两种不同构象的蛋白:O-Mad2和C-Mad2。利用荧光染料AF488和AF647对突变体蛋白进行荧光双标记,对标记后的蛋白样品表征的结果表明双标记成功,实验中可以用双标记后突变体蛋白代替野生型Mad2进行研究,建立了用单分子荧光技术研究Mad2的体系。为进一步利用单分子荧光共振能量转移(sm-FRET)技术研究Mad2折叠/解折叠机理和构象转变机理奠定了基础。(2)利用sm-FRET研究Mad2两种不同构象间的转变及折叠/解折叠动力学过程。sm-FRET检测发现:在生理条件下,Mad2具有两种不同的天然构象,且可以相互转变。O-Mad2和C-Mad2不同浓度盐酸胍的变性实验表明,随着盐酸胍浓度的升高,Mad2构象不断伸展,当盐酸胍浓度为3.5 M时,突变体Mad2-C106A出现了中间态,证明Mad2两种构象是经过中间体进行转变的。(3)利用全内反射荧光显微镜技术(TIRF)研究Mad2构象变化的动态过程。采用BSA固定法,将Mad2蛋白固定在载玻片上,然后利用TIRF技术检测其构象的变化过程,建立了利用TIRF技术研究Mad2蛋白构象变化的体系,为进一步研究其构象变化奠定基础。(4)利用sm-FRET研究Mad2与Cdc20相互作用的过程。通过sm-FRET发现Cdc20能够促进Mad2形成二聚体并发生分子间的FRET,探讨了Mad2与Cdc20间相互作用的机理。