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目的:探讨PI3K信号通路抑制剂LY294002与氢盐水联合应用对非小细胞肺癌A549细胞增殖及凋亡的影响,初步探讨相关信号转导通路在联合应用中的可能作用机制。方法:选取处于对数生长期的A549细胞,将其分为DMSO(对照)组、LY294002组、氢盐水组和LY294002组+氢盐水(联合治疗组)。采用PI3K信号通路抑制剂LY294002和氢盐水单独或联合处理细胞,采用MTT法检测单药或联合治疗对细胞增殖的影响;检测单药或联合治疗对细胞氧化和抗氧化指标超氧化物歧化酶(SOD)活力及丙二醛(MDA)含量的影响;Annexin V/PI双染细胞后,以流式细胞术分析单药或联合治疗对细胞凋亡的影响;Western blot检测单药或联合治疗对HO-1、p65及PI3K/AKT通路中AKT和p-AKT蛋白表达水平的影响。RT-PCR检测的影响HO-1、p65 m RNA表达的影响。结果:(1)与DMS0组相比,LY294002和氢盐水单药治疗组、联合治疗组细胞增殖明显受到抑制(P<0.05),且相对于单药治疗组,LY294002+氢盐水联合治疗组细胞活力明显受到抑制(P<0.05)。(2)相对于DMSO组和单药治疗组,LY294002+氢盐水联合治疗组A549细胞SOD活力下降、MDA含量增加,其中与DMSO组比较,联合治疗组差异显著(P<0.05)。(3)LY294002组+氢盐水联合治疗组细胞的凋亡率为(22.1±1.7)%,明显高于单药LY294002组(9.5±4.7)%和氢盐水组(15.7±0.9)%A549细胞的凋亡率;明显高于DMSO组A549细胞的凋亡率(13.4±1.2)%,差异有统计学意义(P<0.05)。而LY294002组和DMSO组A549细胞的凋亡率差异无统计学意义(P<0.05)。(4)western blot结果显示,相对于DMSO组和单药治疗组,NF-r B p65蛋白表达下降,HO-1蛋白表达下降,其中相对于DMSO组NF-r B p65、HO-1蛋白表达水平显著下降(P<O.01)。(5)RT-PCR结果显示,相对于DMSO组和单药治疗组,NF-r B p65 m RNA表达下降,HO-1 m RNA表达下降,其中相对于DMSO组、LY294002单药组NF-r B p65、HO-1 m RNA表达水平显著下降(P<O.01)。(6)western blot结果显示,相对于DMSO组,LY294002+氢盐水联合治疗组p-AKT/AKT蛋白表达显著下降(P<O.01),其中相对于LY294002、氢盐水单药治疗组,LY294002+氢盐水联合治疗组p-AKT/AKT蛋白表达下降(P<O.05)。结论:LY294002与氢盐水联合治疗可通过抑制PI3K/AKT通路,进而抑制NF-r B、HO-1的表达,抑制氧化应激,抑制A549细胞的增殖,促进A549细胞的凋亡。目的:在这项研究中,我们探讨PARP抑制剂与一线化疗药物吉西他滨在非小细胞肺癌中对DNA损伤修复的合成致死作用及机制。方法:1.将两种PARP抑制剂和吉西他滨单药或联合治疗用于一系列非小细胞肺癌细胞株,用SRB染色检测单药组和联合治疗组在体外实验的对非小细胞肺癌细胞增殖的抑制作用。根据实验检测得出的相关数据用Chou-Talalay方法分析联合用药的联合指数(combination index,CI),分析两种PARP抑制剂与吉西他滨的联合治疗在三种不同的非小细胞肺癌细胞系中是否具有协同作用。2.将非小细胞肺癌细胞分为DMSO组(对照组)、吉西他滨组、BMN673组、BMN673/吉西他滨联合治疗组,采用Annexin V-FITC/PI流式细胞技术检测分析PARP抑制剂BMN673和吉西他滨单药或联合治疗非小细胞肺癌细胞NCI-H23凋亡的影响。3.研究PARP抑制剂BMN673和吉西他滨单药或联合治疗非小细胞肺癌细胞NCI-H23、SK-MES-1凋亡的影响,用Western blot检测单药或联合治疗对cleaved caspase3蛋白表达水平的影响。4.研究吉西他滨是否抑制非小细胞肺癌细胞的同源重组HR修复,从而与PARP抑制剂具有合成致死作用。采用Western blot和单细胞荧光染色检测双链DNA损伤修复标记RAD51,检测吉西他滨单药治疗后对非小细胞肺癌细胞HR修复的影响。5.研究PARP抑制剂BMN673和吉西他滨单药或联合治疗非小细胞肺癌细胞NCI-H23细胞周期的影响,用碘化丙啶(Propidium iodide,PI)染色后流式细胞仪(Flowcytometry,FCM)检测细胞周期。6.研究PARP抑制剂BMN673和吉西他滨单药或联合治疗非小细胞肺癌细胞NCI-H23和SK-MES-1 DNA损伤/DNA损伤修复的影响,用Western blot检测单药或联合治疗对γ-H2AX、Rad17、p RPA蛋白表达水平的影响。采用单细胞荧光染色检测联合治疗对双链DNA损伤标记γ-H2AX,单链DNA损伤标记Brd U的影响。7.评估BMN673和吉西他滨单药及其BMN673/吉西他滨联合治疗对非小细胞肺癌动物实验肿瘤生长的影响。采用免疫组织化学方法检测瘤组织γ-H2AX、cleaved caspase3的表达,进一步验证BMN673/吉西他滨联合治疗非小细胞肺癌相对于BMN673单药和吉西他滨单药对凋亡和DNA损伤的影响。结果:1.PARP抑制剂与吉西他滨联合治疗较PARP抑制剂单药、吉西他滨单药、DMSO对照组对非小细胞肺癌细胞系的生长有协同抑制作用:在NCI-H23、NCI-H522和SK-MES-1三种非小细胞肺癌细胞系,无论BMN673还是AZD2281与吉西他滨联合对细胞的增殖均有明显的抑制作用。同时,所有的细胞系结果均与吉西他滨/顺铂的联合治疗相对比,PARP抑制剂/吉西他滨的联合治疗有与吉西他滨/顺铂这一经典化疗方案类似的CI值。2.PARP抑制剂与吉西他滨联合治疗较PARP抑制剂单药、吉西他滨单药、DMSO对照组能更显著诱导非小细胞肺癌细胞凋亡:采用Annexin V/PI染色后流式细胞仪分析表明,经过48小时药物干预NCI-H23和SK-MES-1细胞株,BMN673/吉西他滨联合治疗组早期和晚期凋亡细胞均较单一药物组和DMSO组升高。Western blot显示cleaved caspase3表达有类似表现。3.吉西他滨对非小细胞肺癌细胞HR同源重组修复无抑制作用:我们发现在NCI-H23和SK-MES-1细胞,吉西他滨增加GFP+细胞表达,表明在这两种细胞HR修复是增加的。为了进一步验证这一点,我们进一步分析了作为HR修复标记的RAD51的表达。Western blot结果和单细胞免疫荧光染色同时检测Rad51均显示RAD51在BMN673单药治疗组、吉西他滨单药治疗组和BMN673/吉西他滨联合治疗组无差异。4.PARP抑制剂与吉西他滨联合治疗能使细胞出现在细胞周期G2/M期的阻滞:BMN673/吉西他滨联合治疗组显示在G2/M期阻滞的细胞较BMN单药治疗组增加近2倍。5.PARP抑制剂与吉西他滨联合治疗通过增加DNA单链断裂导致DNA损伤的协同作用:在NCI-H23和SK-MES-1两种非小细胞肺癌细胞系中,western blot显示BMN673/吉西他滨联合治疗能引起代表DNA双链断裂的γ-H2AX蛋白表达水平较单药治疗组及对照组增加,代表DNA单链断裂的Rad17、p RPA蛋白表达水平显著增加。免疫荧光染色的定量分析显示BMN673/吉西他滨联合治疗使γH2AX(DNA双链断裂的标记)强度较单药治疗组及对照组增加(P<0.05),Brd U(DNA单链断裂的标记)强度增加更为显著(P<0.01)。动物实验免疫组化显示γ-H2AX染色强度明显高于单药治疗组及对照组(P<0.05)。6.PARP抑制剂与吉西他滨联合治疗能抑制非小细胞肺癌动物实验的肿瘤生长:在NCI-H23致裸鼠成瘤动物实验中,与对照组相比,BMN673和吉西他滨单药均对肿瘤生长有抑制作用。与BMN673和吉西他滨单药治疗相比,BMN673/吉西他滨联合治疗能最有效的抑制肿瘤生长,BMN673/吉西他滨联合治疗组显著优于BMN673单药组(P=0.019)或吉西他滨单药组(P=0.033)(图3A-B)。肿瘤组织切片免疫组织化学染色显示,与对照组相比,BMN673单药治疗组、吉西他滨单药治疗组和BMN673/吉西他滨联合治疗组肿瘤组织cleaved caspase3表达明显升高。结果与cleaved caspase-3细胞实验结果一致。结论:我们的研究展示了PARP抑制剂/吉西他滨联合治疗在非小细胞肺癌细胞及动物实验的合成致死作用,联合治疗能抑制肿瘤细胞生长,通过增加其DNA单链和双链损伤,诱导肿瘤细胞凋亡。这种合成致死作用并不伴随同源重组HR修复的改变,可能机制为吉西他滨作用于DNA复制过程致复制叉停滞,停滞的复制叉需要PARP的作用重新启动时,因PARP抑制剂的联合使用使复制叉停滞持续存在,最终导致DNA双链损伤的累积发生致细胞死亡。