近些年全基因组测序方法和大规模基因组注释工程快速发展,由此产生的大量信息给研究者带来的一个主要挑战是如何将这些庞大的数据转变成功能上和临床上相关的知识。这一问题的核心是需要高效可靠的方法使研究者能够确定基因型是怎样影响表现型的。基因敲除技术是研究基因功能的一种有效方法,而CRISPR/Cas9 和 TALENs这两个系统已证明是基因敲除的高效、可靠的工具。斑马鱼是一种优良的动物模型,可用于功能基因组学分析、人类疾病发病机制的研究等。因此,斑马鱼成为应用最先进基因组编辑技术如CRISPR/Cas9 和 TALENs的首选。CRISPR/Cas系统是原核生物所特有的一种抵御外源遗传物质的免疫系统,该系统在序列特异RNA的介导下,能够切割并降解掉外源性的DNA,这些外源的遗传物质包括外源性的质粒或噬菌体。CRISPR/Cas系统有三种类型,其中II型CRISPR/Cas系统的组成最简单,仅需要RNase Ⅲ、crRNA、tracrRNA、Cas9蛋白四种成分就能发挥作用。CRISPR/Cas9介导的基因敲除主要包括以下几个步骤：Cas9靶位点的选择和确认、检测引物的设计；构建gRNA的体外转录载体；gRNA 和 Cas9 mRNA的制备；F0斑马鱼的制备与靶点突变效率检测：FO生殖系的检测；靶位点突变F1成鱼的筛选。TALENs是近年发展起来的一种新型基因敲除方法。它是利用TALEs蛋白核酸结合域氨基酸序列与其靶位点核酸序列之间存在着恒定对应关系,组装出能特异性结合任意DNA序列的模块化蛋白,从而实现DNA编辑修饰操作,如knock-out、碱基替换或基因修饰等。TALENs技术以其快速、高效的优势对生物基因研究领域产生深远影响,为遗传疾病的治疗提供了新的策略。利用化学诱变等方法并通过多年积累,斑马鱼中已经有了一千多种突变体,但是仍然有上万个基因没有相应的突变体。通过敲除这些基因来建立一个较大的斑马鱼突变体库,进一步研究基因的功能,将促进生物学的发展和人类疾病的研究。本实验利用CRISPR/Cas9技术敲除斑马鱼的1号染色体上的Vap、C1H7orf55、 mril 和 BX284640.3基因,并得到相应突变体。其中Vap基因得到缺失7bp一种突变类型；C1H7orf55基因得到插入lbp和缺失16bp两种突变类型；mri1基因得到缺失7bp和缺失40bp两种突变类型；BX284640.3基因得到缺失lbp和缺失2bp两种突变类型。此外,本实验还利用TALENs敲除斑马鱼10号染色体上的dscr6基因,并得到生殖系中存在突变的F0代鱼。对以上基因的敲除为进一步研究这些基因的功能奠定了基础。