研究背景：糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）是一种多功能的丝苏氨酸蛋白激酶，其功能失调可导致多种疾病例如精神疾病、代谢系统疾病以及神经系统退行性疾病的发生发展，而在此过程中，氧化应激也发挥重要作用。多条细胞信号通路参与调节GSK-3β的活性，酪氨酸216位点的磷酸化可以增加GSK-3β的活性，而其丝氨酸9位点的磷酸化则降低GSK-3β的活性，另外，胰岛素途径、wnt信号通路以及与GSK-3结合蛋白之间相互作用等都可调控GSK-3β的活性。我们先前的实验结果已报道过在氧化应激的情况下，GSK-3β活性增高，但是氧化应激是如何参与调节GSK-3β激酶活性的机制不明。已有研究报道，calpain对GSK-3βN端的片段化可导致GSK-3β的抑制结构域丧失，并将GSK-3β切割为两个具有激酶活性的片段，即calpain的激活可截断GSK-3β并使其活性升高。目的：探讨在HEK293/Tau441细胞系中，过氧化氢（H2O2）如何影响GSK-3β的活性及其潜在机制，进一步研究氧化应激中calpain对GSK-3β的片段化在其活性调节中的作用及机制。方法：细胞培养，药物处理后，用CCK-8试剂盒测定细胞活力，同时测定SOD和MDA含量，评估氧化应激模型是否成功建立，检测GSK-3β活性，并运用westernblot技术检测GSK-3β不同位点磷酸化程度以及可能参与磷酸化的相关激酶活性形式的表达；用I×71共聚焦显微镜检测药物处理后不同时间点荧光探针Fura-2-AM标记的HEK293/Tau441细胞内钙离子浓度变化，并运用蛋白免疫印迹分析GSK-3β的片段化程度；随后又用上述实验中所使用的过氧化氢浓度以及calpain的特异性抑制剂Ⅳ同时处理HEK293/Tau441细胞，探究calpain介导的GSK-3β特异性切割。结果：（1）在过氧化氢处理的HEK293/Tau441细胞中，GSK-3β的活性与空白对照组相比增加了两倍，然而GSK-3β的丝氨酸9位点的磷酸化程度也明显升高，即非激活形式的GSK-3β水平升高，同时GSK-3β的酪氨酸216位点的磷酸化程度未出现明显改变；（2）用过氧化氢处理HEK293/Tau441细胞1分钟后，细胞内钙离子浓度开始上升，3分钟细胞内钙离子浓度达到高峰，而后免疫印迹分析结果显示GSK-3β被切割为两个片段；（3）用过氧化氢和calpain特异性抑制剂Ⅳ同时处理HEK293/Tau441细胞，发现GSK-3β的片段化效应明显受到抑制。结论：过氧化氢通过增加细胞钙离子内流激活calpain，引起GSK-3β的片段化，进而对抗由过氧化氢磷酸化丝氨酸9位点诱导的GSK-3β酶活性的下降，从而上调GSK-3β的活性。