β-内酰胺类抗生素，通过干扰细菌细胞壁的合成并破坏已有细胞壁而起到杀菌的作用。目前，β-内酰胺类抗生素的全球销量已达到150亿美元，占着半合成抗生素市场的65％。这其中又以青霉素类(Penicillins)和头孢菌素类药物(Cephalosporins)为主导产品。头孢菌素类药物以其低毒、耐酸、可修饰位点多[1]等优势正日益成为抗生素市场的主流。目前头孢菌素类药物的销售额占到整个抗生素市场的4成，美国达到45％，而日本甚至达到49.34％。　　 头孢菌素类抗生素多是以头孢菌素C(CPC)为原料得到7-氨基头孢烷酸，在此基础上再经过化学修饰，得到各种半合成头孢菌素药物。CPC是顶头孢霉属的代谢产物，在它的生物合成中，最后一步反应是由脱乙酰头孢菌素C(DAC)经乙酰转移酶催化变成CPC[2]，这个过程被证实是CPC生物合成的限速步骤[3]，其原因是乙酰转移酶的表达量太低。目前国内针对乙酰转移酶及其编码基因——cefG的研究并没有太多报道。　　 根据NCBI上的查询结果，产黄头孢霉的cefG基因是一条含两个内含子的基因序列，无法从基因组直接扩增。本文采用体外合成的方法可以得到去掉内含子的cefG基因。以NCBI报道的来源于菌株AJ404737的cefG序列作为模板，去掉内含子，设计38条首尾互补的引物，通过Assembly PCR拼接成一条完整的DNA片段，经测序发现有3个位点发生碱基缺失。通过定点突变的方法对缺失部分逐一修改，并通过竞争性PCR检验突变是否成功。每突变一个位点都经过引物设计、PCR扩增、DpnⅠ消化、转化、验证和测序几个步骤，最终得到与NCBI上所登录的完全匹配的cefG基因。　　 为了得到较高产量和纯度的乙酰转移酶蛋白，用于抗体制备、免疫印迹检测，本实验构建了pET30-cefG表达质粒，37℃下诱导表达出大量重组蛋白，且都是不溶的包涵体。将重组菌超声破碎后，不溶部分用不同浓度尿素做梯度洗脱，最后用8M尿素溶解沉淀，所得乙酰转移酶包涵体纯度达到96％以上，达到抗体制备或免疫印记实验要求。　　 将纯化后的包涵体免疫6周龄的BALB/C雌鼠，约1个半月后取尾血得到抗血清。通过抗原包被的酶联免疫分析技术(ELISA)检测，所得抗体效价达到8000以上，完全满足实验需要。利用所得抗体，本文先绘制出乙酰转移酶标准曲线以确定抗原最适检测浓度，然后在大肠杆菌中检测了乙酰转移酶与菌体生长的关系，证明所制备抗体能够用于体外检测乙酰转移酶。　　 为了使克隆的cefG基因能与产黄头孢霉基因组进行重组并顺利表达，本实验利用威斯康辛大学D.cullen教授馈赠的质粒pDH25构建了真核表达质粒pDH25-cefG。同时制备产黄头孢霉原生质体，研究了原生质体对潮霉素B的耐受性，确定其最低耐受浓度为6μg·mL-1。最后尝试在不同电压下用电转化方法将重组质粒导入产黄头孢霉原生质体。　　 本研究探讨了采用ELISA法，快速、高效、精确地检测乙酰转移酶含量，在头孢菌素生产菌的基因工程改造工作中取得了阶段性成果，为进一步研究cefG基因在头孢菌素生产菌中的克隆与表达奠定了基础。