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小麦蓝矮病(Wheat blue dwarf disease,WBD)由小麦蓝矮植原体引起,常年危害我国西北地区冬小麦,引起小麦叶尖发黄、植株矮化、分糵增生(丛枝),严重影响小麦产量。小麦蓝矮植原体隶属于软壁菌门柔膜菌纲植原体暂定种16SrI组,由昆虫介体异沙叶蝉(Psammotettix striatus L.)持久专化性传播。为探究该病原菌的致病机理,本实验室前期完成了WBD植原体基因组草图的绘制,生物信息学相关软件预测到37个分泌蛋白,通过农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的瞬时表达实验,筛选到一个能够诱导本氏烟(Nicotiana benthamiana)腋芽增生、表现丛枝表型的分泌蛋白-Secreted WBD Protein 1(SWP1)。丛枝症状是大多数植原体病害的典型症状之一,能够增加植物的营养组织,同时产生更多维管束网络,对植原体的侵染致病有着重要意义。然而,植原体诱导寄主植物产生丛枝症状的机理目前还不清楚。本研究拟以WBD植原体分泌蛋白SWP1为研究对象,探究其诱导植物丛枝的机理,为揭示植原体的致病机理和有效控制植原体病害提供理论依据。本研究首先在模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)中开展SWP1转基因实验,观察其诱导丛枝表型的遗传稳定性;随后,通过酵母双杂交(Yeast two-hybrid,Y2H)及双分子荧光互补实验(Bimolecular fluorescence complementation,BiFC)筛选到SWP1在拟南芥中的互作靶标为TEOSINTE BRANCHED1-CYCLOIDEA-PROLIFERATING CELL FACTOR(TCP)家族转录因子BRANCHED1(BRC1);进一步研究发现SWP1通过26S蛋白酶体途径促进BRC1的降解,干扰BRC1抑制腋芽生长的功能,从而导致植物产生丛枝表型。本研究获得的主要结果如下:1.WBD植原体效应子SWP1在拟南芥中稳定表达诱导丛枝表型。首先利用酵母信号肽筛选方法(Yeast signal sequence trap,YSST)鉴定了SWP1信号肽的分泌功能,结果表明SWP1为分泌蛋白。随后构建含核定位信号及核输出信号的SWP1突变体,在本氏烟中过表达,表型观察发现,与过表达含核定位信号SWP1突变体的本氏烟植株相比,含核输出信号SWP1突变体的过表达植株并不表现丛枝症状,表明SWP1在细胞核中表达对其诱导丛枝表型的功能至关重要。此外,我们通过农杆菌介导的拟南芥浸花转化方法,获得纯合的T3代SWP1转基因植株(35S::SWP1),观察表型发现,与拟南芥野生型植株(Col-0)相比,35S::SWP1植株的分枝数目明显增多。以上结果表明,SWP1能够诱导拟南芥产生丛枝表型。2.WBD植原体效应子SWP1与拟南芥转录因子BRC1互作。利用Y2H库方法,以SWP1为诱饵蛋白筛选拟南芥幼苗期cDNA文库;同时,利用BiFC方法验证SWP1与拟南芥TCP class II亚家族转录因子的互作;结果发现SWP1与BRC1互作,Y2H实验进一步确认了二者之间的互作。共定位实验及BiFC实验发现BRC1与SWP1的互作位置为植物细胞核。同时,Y2H实验鉴定出SWP1的卷曲螺旋结构域(Coiled-Coil domain,CC)以及BRC1的TCP结构域均为SWP1与BRC1互作的关键结构域。为探究WBD引起的丛枝症状是否与SWP1和BRC1的互作有关,克隆WBD植原体不同寄主植物中BRC1同源基因,利用Y2H实验验证其编码蛋白与SWP1的互作关系。结果发现短柄草(Brachypodiumdistachyon)及长春花(Catharanthusroseus)中BRC1同源蛋白与SWP1有强互作关系,而番茄(Solanumlycopersicum)中的SlBRC1b与SWP1无强互作关系。这一结果与WBD植原体侵染寄主植物后是否表现丛枝症状高度一致(长春花和大多单子叶植物被WBD植原体侵染后表现丛枝症状,而番茄被其侵染后并不表现丛枝症状),表明WBD诱导寄主植物产生的丛枝症状很可能是由SWP1与BRC1的互作介导的。3.WBD植原体效应子SWP1通过26S蛋白酶体途径降解BRC1诱导植物表现丛枝表型。BRC1在植物腋芽内特异性表达,抑制腋芽生长。SWP1转基因拟南芥植株与拟南芥brc1缺失突变体的表型极为相似,我们推测SWP1可能干扰了BRC1的功能。为验证这一推测,我们将BRC1与SWP1在本氏烟中共表达,Western blot检测BRC1的蛋白丰度。结果发现,与对照组BRC1与GFP共表达样品相比,BRC1与SWP1共表达样品中,BRC1蛋白丰度明显降低。RT-PCR检测发现BRC1的转录水平在各个样品中无显著变化,表明SWP1促进BRC1的蛋白降解。同时发现26S蛋白酶体抑制剂(PS341及Epoxomicin)处理BRC1与SWP1共表达样品后BRC1的降解恢复,表明SWP1通过26S蛋白酶体途径促进BRC1的降解。综上所述,SWP1通过26S蛋白酶体途径促进BRC1的降解,干扰BRC1的正常功能,从而解除了BRC1对腋芽生长的抑制作用,导致植物产生丛枝症状。本研究首次揭示了植原体诱导丛枝效应子的作用机理,为植原体致病机理的研究以及植原体病害的防治奠定了理论基础。