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实验目的:方证相应,是现代中医药临床遣药用方和基础理论研究的基本思维和基本原则。中医证候模型是中医药基础研究的重要工具,也是连接基础研究和临床实践的重要纽带。目前,中医证候模型研究进展十分缓慢,在一定程度上可以说该方面的不足是限制方剂、证候等基础研究进一步发展的桎梏和瓶颈之一。桂枝汤,被誉为“群方之冠、万方之祖”,主治太阳中风表虚证,是我们课题组近30年来致力研究的经方。基于方证相应原则和课题组前期探索,借鉴现代医学的内环境和微环境学说,吸收近年来免疫学发展成果,以病毒模拟物{聚肌胞[Polyinosinic polycytidylic Acid,Poly(I:C)]}-细菌模拟物[脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)]不同配比组合刺激大鼠肺巨噬细胞NR8383,以桂枝汤含药血清干预,观察其下游通路元件和效应分子——Toll样受体(Toll-Like Receptors,TLRs)和细胞因子的表达和分泌,旨在探索一种针对桂枝汤的体外细胞汤证模型,并为进一步建立桂枝汤汤证动物模型积累数据。将体外细胞汤证模型所得的Poly(I:C)-LPS配比,对SD大鼠进行体内实验验证,同时用桂枝汤、麻黄汤、桑菊饮、银翘散进行干预,利用肛温、脑和肺的系数、肺组织中的蛋白表达及其Toll样受体mRNA的表达等指标进行评价,旨在探索尝试建立桂枝汤汤证的动物模型,为进一步更好的揭示经方桂枝汤功效以及其对应证——太阳中风表虚证的现代科学内涵服务,同时也为其他汤证研究提供可资参考的方法和思路。实验内容1.桂枝汤含药血清对不同配比的Poly(I:C)-LPS组合刺激大鼠肺巨噬细胞(NR8383)的干预效应采用大鼠肺的巨噬细胞(NR8383)进行体外实验,通过CCK-8法(Cell Counting Kit-8,CCK-8法)检测桂枝汤含药血清对NR8383细胞活性的影响,确定适宜的体外干预浓度。通过酶联免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay,Elisa)分别测定 Poly(I:C)、LPS 对 NR8383 细胞刺激分泌肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)和白细胞介素-1β(Interleukin-1 β,IL-1 β)的时效、量效关系,依此确定的适宜的刺激时间以及合适的浓度区间[为进行后面的体内实验,采用国产注射剂Poly(I:C)与美国InvivoGen公司、美国Sigma公司的Poly(I:C)进行比较]。通过 Elisa 法和实时荧光定量 PCR 法(Quantitative Real-time PCR,RT-PCR)分别测定 Poly(I:C)-LPS(50:1、40:1、30:1、20:1、10:1)五个比例组合刺激NR8383细胞的TNF-α、IL-1β的蛋白表达以及TLR-2、3、4、6 mRNA的表达,以及桂枝汤含药血清干预后的表达情况。通过主成分分析法、系统聚类法分析上述数据,得出刺激效果最好或者桂枝汤含药血清干预最好的 Poly(I:C)-LPS 比例。2.解表四方对不同配比Poly(I:C)-LPS组合的造模大鼠干预作用的研究采用SD大鼠作为体内实验对象,分别利用50:1、30:1、10:1三个配比组合(这三个比例组合也是体外实验刺激反应较优的组合,10:1是桂枝汤含药血清干预最好的组合,50:1是刺激效应最显著的组合,30:1的刺激效应和干预效应次于前两者)进行体内实验,同时进行桂枝汤、麻黄汤、桑菊饮、银翘散等四方的干预,通过对体温、肺和脑组织系数、肺组织中的IL-1 β、TNF-α蛋白表达的含量,Toll-3、4 mRNA的表达等指标进行评价,并通过主成分分析法进行分析,旨在尝试得到桂枝汤汤证模型的Poly(I:C)与LPS的造模比例(或区间),或者是麻黄汤汤证模型、桑菊饮汤证模型、银翘撒汤证模型的造模比例。实验结果1.通过CCK-8法确定桂枝汤含药血清的无毒剂量是9.4g · kg 1 · U-(即细胞总体积的20%)。2.Elisa法确定的造模时间为6h,三个公司的Poly(I:C)刺激浓度为50μg·mL-1以下,LPS刺激浓度为1μg·mL-1。3.采用 Poly(I:C)-LPS 浓度比为 50:1、40:1、30:1、20:1、10:1 刺激 NR8383细胞,通过主成分分析法和系统聚类法得出,50:1为刺激效应最为显著的浓度比,10:1为桂枝汤干预效应最好的浓度比。4.用Poly(I:C)与LPS比例组合为50:1、30:1、10:1,进行大鼠体内模型复制,采用肛温、肺和脑指数、肺上清中IL-1 β和TNF-α蛋白表达情况、肺组织中TLR-3、4 mRNA表达等七个指标评价,利用主成分分析法对结果进行综合分析,结果表明银翘散对于50:1的组合有较好的干预性,麻黄汤对30:1的组合干预性显著,桂枝汤对10:1的组合具有显著的干预性。实验结论:体内实验与体外实验结果基本一致,初步可以得出,Poly(I:C)与LPS比例为10:1时,可能是桂枝汤汤证模型的较合适造模比例,这尚待进一步深入验证;同时提示,比例为30:1左右时,可能较为适合麻黄汤汤证模型的探索剂量;而比例为50:1左右时,可能更适合银翘散汤证模型造模。上述结果为进一步建立并验证桂枝汤汤证模型以及其他解表方剂汤证模型提供了实验依据。注:汤证模型,即针对某一具体方剂的证候模型。