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猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的高度传染性疾病,给全球养猪业带来了巨大的经济损失,严重危害我国养猪产业。因此,揭示PRRSV抑制免疫应答反应的机制将有助于预防和控制PRRS。我们发现PRRSV可能通过调控宿主miR-541-3p的方式抑制机体先天性免疫应答反应。首先,将miR-541-3p的模拟物或抑制物转染MARC145细胞,然后再感染PRRSV,实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和TCID50实验结果显示前者显著促进PRRSV复制,而后者显著抑制PRRSV复制,这暗示miR-541-3p能够促进PRRSV复制。进一步的研究表明PRRSV能够促进MARC145细胞中miR-541-3p的表达。以前的研究表明Ⅰ型干扰素（IFN-Ⅰ）能够拮抗PRRSV,因此,我们探讨了miR-541-3p能否抑制Ⅰ型干扰素的转录。qRT-PCR实验结果显示miR-541-3p的模拟物显著地抑制poly（I:C）诱导的IFN-β转录,而miR-541-3p的抑制物显著地增强poly（I:C）诱导的IFN-β转录,这暗示miR-541-3p能够反向调控IFN-β转录。随后,通过靶基因的预测和初步验证,发现靶基因MAVS、IRAK2、IRAK3、IRAK4、TRAF3、IRF7、IFNAR1和IFNAR2可能是miR-541-3p的候选靶基因,qRT-PCR实验结果显示miR-541-3p的模拟物显著抑制（interferon regulatory factor 7）IRF7的表达,miR-541-3p的抑制物显著增强IRF7的表达,双荧光素酶实验结果表明miR-541-3p可以靶向IRF7的3’-UTR,这暗示miR-541-3p通过靶向IRF7的方式下调Ⅰ型干扰素转录。更重要的是,免疫印迹实验和qRT-PCR实验结果表明PRRSV能够抑制IRF7的表达,过表达IRF7能够抑制PRRSV复制,而沉默IRF7能够促进PRRSV复制。综上所述,本实验发现PRRSV能够上调miR-541-3p的表达,而后者又通过靶向IRF7的方式下调Ⅰ型干扰素转录进而促进PRRSV复制,这暗示PRRSV可能通过调控宿主的miR-541-3p而抑制机体的免疫反应,达到病毒免疫逃逸的目的。以前的研究表明PRRSV基因组RNA可以被RIG-Ⅰ样受体（RLR）受体识别,而后者再通过其唯一接头蛋白线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）介导Ⅰ型干扰素转录,从而拮抗PRRSV。我们课题组前期工作发现IFI16（interferonγ-inducible protein 16）通过与（Mitochondrial antiviral-signaling protein）MAVS相互作用的方式增强MAVS介导的IFN-Ⅰ转录和拮抗PRRSV复制,但二者的分子机理还不清楚。因此本研究对IFI16正向调控IFN-β转录的分子机制加以探讨。由于IFI16能够显著地促进MAVS诱导的IFN-β转录,本实验首先探讨了IFI16是否协同促进MAVS诱导的IFN-β转录,将高低不同浓度的IFI16和MAVS真核表达载体与IFN-β启动子报告质粒共转染HEK293T细胞,双荧光素酶结果显示单独转染IFI16或MAVS质粒均能够诱导IFN-β转录,但IFI16诱导的能力显著低于MAVS（即VISA）所诱导的,更重要的是,IFI16和MAVS共转染组的干扰素活性显著高于单转染组,这提示IFI16可能协同MAVS促进IFN-β转录。MAVS作为接头蛋白,其形成多聚体以及本身的磷酸化是信号通路RLR-MAVS-IFN-Ⅰ活化所必需的,因此,本实验构建了无法形成多聚体MAVS的突变体（MAVS-E26A）和模拟磷酸化的活化型突变体（MAVS-S442D）,免疫共沉淀的结果表明IFI16不与多聚体失活突变体MAVS-E26A相互作用,IFI16与MAVS-E26A共转染也不能促进IFN-β转录,而MAVS-S442D与IFI16在协同IFN-β表达上优于野生型MAVS,这提示IFI16与MAVS所介导的IFN-β转录是IFI16正向调控MAVS-IFN-β,这也暗示MAVS参与IFI16与MAVS共同介导的IFN-β转录。那么,IFI16介导IFN-β转录是否依赖于MAVS?本研究采用了两种方案对此加以探讨,一方面研究IFI16是否正向调控MAVS上游蛋白与下游信号通路蛋白所介导的IFN-β转录,即,将IFI16以及IFN-β启动子报告质粒、IRF3或NF-κB结合序列报告基因分别同真核表达质粒RIG-N、IRF3（5D）、IKKε或TRIF共转染MARC145细胞,双荧光酶实验结果表明IFI16能够协同RIG-N、IRF3（5D）、IKKε以及TRIF促进IFN-β启动子活化、IRF3结合序列报告基因活化以及NF-κB结合序列报告基因活化。另一方面利用CRISPR/Cas9技术构建MAVS缺失细胞系去探讨MAVS在IFI16正向调控IFN-β转录中的作用,结果显示在MARC145 MAVS-/-细胞系中,我们重复了上述实验,然后发现IFI16依然能够协同IRF3（5D）、IKKε、TRIF促进IFN-β启动子、IRF3结合序列报告基因及NF-κB结合序列报告基因活化,但是无法协同RIG-N。这表明MAVS在IFI16正向调控IFN-β转录中不是必需的。进一步实验发现,在HEK293T细胞中过表达IFI16后,NEMO的m RNA表达水平及蛋白水平显著增强,并且我们还发现NEMO能够增强IFI16协同IKKε促进IFN-β表达的能力。综上所述,本实验发现IFI16通过非MAVS依赖方式正向调控IFN-β转录。