目的:缺氧是常见的导致血管内皮受损的因素之一。大多数心血管疾病发生都是由于血管内皮损伤后引起的,因此积极控制对血管内皮细胞有损伤作用的因素对预防心血管疾病的发生有着重要的意义。Micro RNA-155(mi R-155)是一个典型的多功能的micro RNA,在心血管疾病发生发展过程中发挥着关键的作用。最近有研究提示,mi R-155对心血管疾病相关细胞---内皮细胞、单核巨噬细胞以及血管平滑肌细胞的功能均有不同程度的影响。KLF4和KLF5是KLF家族中重要的成员,它们都是含有锌指样结构的转录因子,在调控细胞增殖、分化以及组织形成等方面都发挥着重要的作用。SUMO化(sumoylation)是一种类泛素化的翻译后修饰方式。SUMO化可引起蛋白质表面特征的改变并调控蛋白质间的相互作用,从而影响靶蛋白定位、活性以及稳定性等多方面的性质。通心络(Tongxinluo,TXL)是一种中药复方提取物,在临床上主要用于治疗心脑血管疾病。本研究旨在为阐明通心络对血管内皮细胞紧密连接蛋白的保护作用及其分子机制以及为其扩大临床应用范围提供实验依据。方法:将C57BL/6J小鼠随机分为对照组,缺氧组和缺氧+通心络预孵育组。mi R-155敲除(mi R-155-/-)小鼠随机分为缺氧组和缺氧+通心络预孵育组。缺氧组和缺氧+通心络预孵育组置于自制低压氧舱内,每天6小时,共28天。通心络预孵育组按7.5mg/10g体重每天给予通心络超微粉混悬液灌胃。28天后取小鼠主动脉进行免疫荧光染色。培养人心脏微血管内皮细胞,分组给予通心络和缺氧刺激,Western bolt方法分别检测紧密连接蛋白,HIF-1a,UBC9,KLF4以及KLF5的表达。用GFP和mi R-155腺病毒刺激人心脏微血管内皮细胞并用靶向mi R-155的si RNA敲低mi R-155转染人心脏微血管内皮细胞,用Western bolt方法检测在过表达mi R-155或敲低mi R-155时紧密连接蛋白的表达;用q RT-PCR方法检测对照组、缺氧组及缺氧+通心络预孵育组小鼠主动脉内mi R-155的表达;免疫共沉淀(COIP)的方法检测缺氧、通心络刺激条件下KLF4和KLF5与UBC9的相互作用以及KLF4和KLF5的苏素化水平。通过双荧光素酶报告基因检测系统分析KLF4及KLF5的苏素化对mi R-155启动子活性的影响。结果:1通心络可以上调缺氧抑制的紧密连接蛋白的表达免疫荧光结果显示,慢性缺氧组主动脉内紧密连接蛋白阳性细胞数少于正常对照组,与缺氧组相比,缺氧+通心络预孵育组小鼠主动脉内紧密连接蛋白阳性细胞数明显增加。Western bolt结果与其相一致。提示缺氧可以下调紧密连接蛋白的表达,而通心络可以逆转缺氧对紧密连接蛋白的影响。2通心络抑制缺氧诱导的mi R-155表达我们通过Real-time PCR检测了mi R-155在缺氧组小鼠主动脉中的表达变化。结果显示,与对照组相比,缺氧组小鼠主动脉内mi R-155表达明显增加,而缺氧+通心络预孵育组小鼠主动脉内mi R-155表达明显低于缺氧组。这表明缺氧可以诱导mi R-155的表达,而通心络可以抑制缺氧诱导的mi R-155的表达,与之前文献报道结果一致。以上结果提示我们,缺氧抑制的紧密连接蛋白表达可能与mi R-155的差异表达有关。3 mi R-155调控紧密连接蛋白的表达为了验证上述假说,我们在整体水平上应用mi R-155敲除小鼠检测了mi R-155对紧密连接蛋白的影响。结果发现:mi R-155-/-小鼠主动脉内紧密连接蛋白claudin1,occludin,VE-cadherin,beta-catenin及ZO-1阳性颗粒数多于野生型小鼠,提示mi R-155可以在体内调控紧密连接蛋白的表达。接下来我们分别用腺病毒过表达mi R-155和靶向敲低mi R-155的si RNA感染人心脏微血管内皮细胞,在体外用Western bolt方法检测内皮细胞中紧密连接蛋白claudin1,occludin,VE-cadherin,β-catenin及ZO-1的表达情况,结果与免疫荧光染色结果相一致。上述结果显示,mi R-155可以显著抑制紧密连接蛋白的表达。4通心络影响缺氧条件下HIF-1α,UBC9,KLF4,KLF5表达为了进一步明确,通心络调控mi R-155表达的分子机制,我们通过免疫荧光染色首先检测了HIF-1α,UBC9,KLF4,KLF5表达的变化情况。结果显示,在慢性缺氧情况下,小鼠主动脉内HIF-1α及KLF5的阳性细胞颗粒明显多于正常对照组,而UBC9及KLF4的阳性细胞颗粒少于正常对照组;而缺氧+通心络预孵育组小鼠主动脉内HIF-1α,UBC9,KLF4及KLF5阳性细胞颗粒明显高于慢性缺氧组。Western blot结果与免疫荧光染色结果相一致。上述结果表明,通心络可以提高小鼠对慢性缺氧的适应能力以及KLF4,KLF5和UBC9的表达。5通心络影响UBC9与KLF4,KLF5之间的相互作用既然缺氧可以降低KLF4和UBC9的表达、上调KLF5的表达,而通心络调控mi R-155表达进而影响紧密连接蛋白表达是否和KLF4,KLF5及UBC9有关呢?我们在体外培养了人心脏微血管内皮细胞,通过免疫共沉淀(COIP)的方法检测了KLF4,KLF5与UBC9之间的相互作用。结果发现,与对照组相比,缺氧可以减弱UBC9与KLF4的相互作用而促进UBC9与KLF5之间的相互作用。而通心络可以逆转缺氧诱导的UBC9与KLF4,KLF5之间的相互作用。6通心络影响KLF4和KLF5苏素化水平UBC9是苏素化的关键酶。既然通心络可以促进UBC9与KLF4之间的相互作用、抑制UBC9与KLF5之间的相互作用,那么通心络对KLF4,KLF5的苏素化水平是否也会有影响?免疫共沉淀检测KLF4,KLF5苏素化的结果显示,在缺氧情况下,KLF4的苏素化水平明显降低,而KLF5的苏素化水平明显增加。与缺氧组相比,通心络预孵育组KLF4的苏素化水平明显增加而KLF5的苏素化水平明显降低。上述结果说明,通心络可以逆转缺氧引起的KLF4及KLF5苏素化水平的变化。7 KLF4的苏素化可以抑制mi R-155的表达,而KLF5的苏素化不影响mi R-155的表达既然缺氧可以抑制KLF4的苏素化、促进KLF5的苏素化,而又可以促进mi R-155的表达,那么苏素化的KLF4和苏素化的KLF5是否可以影响mi R-155的表达呢?为了探讨mi R-155基因表达上调是否与KLF4的苏素化及KLF5的苏素化有关,我们采用脂质体介导法将mi R-155启动子的报告基因质粒与KLF4,KLF5,UBC9和UBC9突变表达质粒及内参照质粒共转染293A细胞,通过双荧光素酶报告基因检测系统定量分析启动子的活性。结果显示,在293A细胞中,KLF4和UBC9表达质粒共转染细胞时,可显著抑制报告基因的表达活性。当KLF5和UBC9表达质粒共转染细胞时,对mi R-155启动子的活性无明显变化。以上结果说明,KLF4的苏素化抑制mi R-155报告基因表达活性,而KLF5的苏素化对mi R-155的表达影响不大。结论:1通心络可以改善缺氧诱导的紧密连接蛋白的表达。2通心络抑制缺氧诱导的mi R-155表达。3 Mi R-155可以调控紧密连接蛋白的表达。4通心络影响缺氧条件下HIF-1α,UBC9,KLF4,KLF5表达。5通心络影响UBC9与KLF4,KLF5之间的相互作用。6通心络影响KLF4和KLF5苏素化水平。7 KLF4的苏素化可以抑制mi R-155的表达,而KLF5的苏素化不影响mi R-155的表达。8通心络调控血管内皮细胞紧密连接蛋白的表达,其分子机制与诱导KLF4和UBC9相互作用,促进KLF4苏素化,抑制mi R-155表达有关。The mechanism of TXL on endothelial cell injury induced by