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研究目的:KATP通道即ATP敏感钾离子通道（ATP-sensitive K+channel）,是一种位于细胞膜上的钾离子通道。KATP通道分布广泛,高表达于心肌、骨骼肌、胰腺等,在心脏缺血和高胰岛素血症等病理条件下,KATP通道在细胞膜上的表达密度下降,而且有大量研究表明,维持KATP在细胞膜上的密度与心脏保护、维持正常血压和胰岛素分泌等息息相关。由此可见,维持KATP在细胞膜上的密度具有重要治疗潜力。细胞膜上KATP通道密度的维持主要依赖其内吞与再循环的动态平衡,但KATP通道再循环的分子机制尚不清楚。真核细胞中的Rab GTPase家族是膜蛋白转运的关键调控者,包括膜蛋白再循环过程。因此,本课题旨在研究与再循环直接相关的Rab家族成员,通过探究其对KATP通道再循环的调控作用,为KATP通道转运缺陷相关疾病的治疗提供新的治疗策略。研究方法:1.构建心肌细胞中的KATP通道亚基类型的质粒Kir6.2和SUR2A以及Rab GTPase家族中与再循环直接相关的成员的显性负性突变型（Dominant-negative mutant,DN）质粒:Rab4-S22N,Rab11a-S25N,Rab11b-S25N,Rab35-S22N。2.为了探究哪一个Rab成员影响KATP通道在细胞膜上的表达密度,以及是否影响KATP通道性质,本研究将KATP通道两种亚基的质粒,和空载质粒或Rab-DN质粒,共转染到HEK 293t细胞中,做KATP通道单细胞内膜向外膜片钳（Inside-out patch clamp）记录、生物素标记的细胞表面膜蛋白提取和蛋白质免疫印迹（Western blotting）,分析电流幅度、单通道电流与开放概率,以及Western blotting灰度值。3.为了探究Rab-DN是否是通过作用于KATP通道再循环影响KATP通道在细胞膜上的表达密度,本研究将KATP通道两种亚基的质粒,和空载质粒或Rab-DN质粒,共转染到Hela细胞中。通过对正常培养的细胞孵育一抗来标记已经转运到细胞膜上可以参与内吞与再循环的KATP通道,分别检测共定位和再循环的细胞免疫荧光。对图像进行共定位分析,统计不同Rab影响下KATP通道所在囊泡的大小,并定量再循环到细胞膜上的通道信号。4.为了探究PI3K-Akt信号通路是否参与Rab对KATP通道在细胞膜表达密度的调节,本研究构建相应Rab的组成性激活突变型（constitutively active mutant,CA）质粒,和KATP通道两种亚基的质粒共转染进HEK 293t细胞,用PI3K-Akt信号通路的抑制剂LY294002处理,做KATP通道单细胞内膜向外膜片钳与Western blotting,分析电流幅度、单通道电流与开放概率,以及Western blotting灰度值。5.为了验证在细胞系中所得实验结果是否适用于原代心肌细胞,本实验包装相应Rab的失活突变型（Rab-DN）和激活突变型（Rab-CA）的腺病毒,以mCherry为阴性对照,分离大鼠心肌细胞进行腺病毒侵染,做KATP通道单细胞内膜向外膜片钳记录,分析电流幅度、单通道电流与开放概率。实验结果:1.Rab35-DN下调KATP通道在细胞膜上的密度。将Rab-DN转染进HEK 293t细胞中,做KATP通道单细胞内膜向外膜片钳实验得到:对照组与四种Rab-DN组中,单通道电流与通道开放概率各组间无显著性差异,但Rab35-DN组KATP通道电流幅度显著低于其他组。提取膜蛋白做Western blotting实验得到:对照组与四种Rab-DN组中,Rab35-DN组细胞膜上KATP通道的数量显著小于其他组。2.Rab35-DN减缓KATP通道再循环,导致KATP通道在细胞内的积累。Rab-DN转染进Hela细胞中,检测共定位的细胞免疫荧光实验得到:四种Rab-DN组中,Rab35-DN与KATP通道共定位系数M2显著高于其他组,KATP通道在Rab35-DN组中所在囊泡大小显著高于其他组。检测再循环的细胞免疫荧光得到:再循环的KATP通道信号,对照再循环0h组与Rab35-DN再循环0h组之间无显著性差异,Rab35-DN再循环2 h组回到细胞膜的KATP通道信号显著小于对照再循环2 h组。3.Rab35-CA上调KATP通道在细胞膜上的密度,PI3K-Akt信号通路不参与Rab35对KATP通道细胞膜表达密度的调控。Rab35-CA转染进HEK293t细胞中,LY294002处理细胞。KATP通道单细胞内膜向外膜片钳实验得到:单通道电流与通道开放概率在各组间无显著性差异;LY294002处理使Akt的磷酸化水平显著下调;Rab35-CA组的电流幅度显著大于对照组,但LY294002处理无显著影响。KATP通道的表达总量在Rab35-CA与对照组之间无显著性差异,也不受LY294002处理的影响。4.Rab35-CA上调大鼠心肌细胞中KATP通道在细胞膜上的密度。分离大鼠心肌细胞腺病毒侵染后做内膜向外膜片钳得到:电流幅度Rab35-CA组显著高于其他组,单通道电流和通道开放概率各组间无显著性差异。结论:Rab35是调控KATP通道再循环的关键分子,Rab35失活导致KATP通道的再循环速率下降、KATP通道在细胞膜上的表达密度减小,电流幅度减小。Rab35激活可以增大心肌细胞KATP通道电流,提示Rab35是治疗KATP通道转运相关疾病的潜在药物靶点。