背景和目的:肾移植是目前治疗终末期肾脏疾病最有效的方法。成功的肾移植可使移植肾具有较高的长期存活率,术后患者的长期存活率和生活质量也高于透析患者。目前,肾移植技术已日趋成熟,影响移植肾存活率的主要因素是肾移植后排斥反应的发生。免疫抑制剂的问世虽然使肾移植取得了里程碑式的进步,但每天给予非特异性免疫抑制剂易引发二重感染、肿瘤等严重的并发症,绝大部分神经钙蛋白抑制剂尚有肾毒性作用。因此,诱导对移植物的免疫耐受是解决排斥的最理想方法[1],也是当今移植学界研究的热点。肾移植排斥反应是由于T细胞的异常活化。T细胞的活化取决于第一信号与第二信号(共刺激信号)的共同作用,第一信号是抗原提呈细胞(antigen presenting cell,APC )提呈的抗原肽-MHC分子( major histocompatibility complex molecules-antigen,MHC-Ag)复合物与T细胞表面的受体(T cell receptor,TCR)结合;第二信号是T细胞表面的共刺激分子与APC表面的配体结合,包括B7-CD28/CTLA4、CD40-CD154等,其中最重要的是由抗原提呈细胞表面的B7分子与T细胞表面的CD28/CTLA4结合产生。细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T lymphocyte associated antigen 4,CTLA4)是细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)上的一种跨膜糖蛋白[3]。CTLA4可阻断B7/CD28共刺激信号通路,使接受了第一信号的异体抗原反应性细胞处于无反应状态,甚至于程序性死亡,使细胞增殖和分化成细胞毒淋巴细胞的作用受抑制,诱导淋巴细胞成为对特异性抗原无反应性的T细胞[1-4]。CTLA4-Ig是将CTLA4的胞外区与人IgFc段的CH2、CH3及γ区的氨基酸相结合而形成的一种融合蛋白,它仍保持与B7结合的生物学特性,却又具有了能溶于水和易于纯化的优点[15]。目前,很多研究报道了无反应性T细胞在体内和体外具有特异性免疫抑制活性[5-7]。在人类骨髓移植中,使用无反应性T细胞能降低移植物抗宿主性[8-10,61]。因此,人们推测,应用体外产生的无反应性T细胞也能诱导人类实体器官的同种异体移植物的长期存活。本实验利用大鼠作为研究对象,应用CTLA4-Ig阻断B7/CD28共刺激通路制备无反应性T细胞,将无反应性T细胞通过尾静脉注射转移到肾移植受体,探讨无反应性T细胞对同种异体移植肾能否诱导免疫耐受的产生及其机理。为临床肾移植排斥反应的治疗寻找一种新的安全有效的方法。方法:1.大鼠脾细胞混悬液的制备[18]。2.混合淋巴细胞反应:体外加入CTLA4-Ig到以SD大鼠脾细胞作为反应细胞和以Wistar大鼠脾细胞作为刺激细胞的混合淋巴细胞反应中培养,检测所得混合供受脾细胞有无增殖,没有发生增殖的为无应性T细胞。进一步检测这些无反应性T细胞在体外能否抑制同种异体活性T细胞反应,并检测无反应性T细胞的抑制作用能否被rIL-2逆转。3.构建大鼠同种异体原位肾脏移植模型。4.实验分组与输注细胞:将34只受体SD大鼠随机分为A、B、C、D四组,A组为实验组,B、C、D组为对照组。分组依据为受体输注的细胞种类,A组:输注(供体脾细胞+受体脾细胞+CTLA4-Ig)制备的4×107无反应性T细胞(10只);B组:输注4×107供受体脾细胞(10只);C组:输注(第三方脾细胞+受体脾细胞+CTLA4-Ig)制备的4×107无反应性T细胞(8只);D组:输注1mlPBS(6只)。5.观察大鼠移植肾的存活时间及其组织病理变化:记录21只受体大鼠移植肾的存活时间;另13只肾移植术后第3、11、28、60天,每组每天取一只受体的移植肾制作光镜切片,观察组织病理变化,并做Banff系统综合评分[60]。结果:1.在供受体脾细胞的初级MLR中, CTLA4-Ig抑制了T细胞的增殖,随浓度增加抑制能力增强,增殖反应在CTLA4-Ig10μg/ml时被完全抑制。而PBS对照组的MLR发生了增殖。每个浓度的增殖值两两比较: p<0.05,差异有统计学意义。2.无反应性T细胞能抑制相同供受体脾细胞MLR的增殖,随无反应性T细胞/混合淋巴细胞的比率增高,其抑制作用增强。每个比率的增殖值两两比较: p<0.05,差异有统计学意义。3.加入rIL-2到无反应细胞和以供体脾细胞作为刺激细胞的次级MLR中,随rIL-2加入量的增加,其逆转作用增加。且高剂量的rIL-2(100 U/ml),引起了无反应状态的完全逆转。每个剂量的增殖值两两比较: p<0.05,差异有统计学意义。4.大鼠移植肾的平均存活时间比较:A组大鼠移植肾的平均存活时间(mean survival time,MST)为(102.0±92.0)天,较B组(10.6±2.3)天、C组(18.6±2.3)天和D组(8.0±1.8)天均明显延长(p均<0.05)。5.移植肾的组织病理变化:(1)肉眼观察: A组大鼠移植肾的大小基本正常,表面色鲜红,均匀、明亮;其它三组移植肾均有明显的肿胀和出血,体积增大,质坚而脆,表面呈深紫红色,呈“大红肾”。(2)光镜检查:A组大鼠移植肾间质仅见少量淋巴细胞及单核样细胞浸润,肾细小动脉无浸润,肾小球、肾小管基本正常。其它三组均出现急性细胞性或血管性排斥反应。(3)Banff系统综合评分: A组大鼠移植肾的总分值低于其它三组,组织学损伤较其它三组轻(p均<0.05,有统计学意义)。结论:1.体外研究表明, CTLA4-Ig阻断B7/CD28共刺激通路能诱导无反应性T细胞的产生。2.无反应性T细胞转移到同种异体移植受体后,能抑制大鼠肾脏同种异体排斥反应,延长移植肾的存活时间。