吡咯烷二硫代氨基甲酸酯对2型糖尿病大鼠肝糖代谢的影响及肝损伤的保护作用

来源 :河北医科大学 | 被引量 : 3次 | 上传用户:chenhua99
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肝脏是血糖调节的重要器官,肝糖代谢对维持机体葡萄糖代谢稳态(glucose homeostasis)起了关键性作用,肝脏对于血糖的调节主要是通过糖原合成和糖异生来实现的。机体摄入高碳水化合物饮食后,胰岛素分泌增多,一方面促进肝脏糖原合成增加,另一方面使肝脏糖异生减少,结果使肝糖输出减少,从而防止餐后血糖升高;空腹或饥饿状态下,胰岛素分泌减少,胰高血糖素释放增多,肝脏糖原分解,糖异生酶表达增多,肝糖输出增多。胰岛素绝对不足或功能障碍,而使肝糖原合成及糖异生功能异常,肝脏糖代谢功能失调,是糖尿病血糖升高的重要原因。吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)为二硫氨基酸酯,其分子上含有巯基(thiol)结构,具有抗氧化及金属螯合作用。PDTC可以特异性抑制NF-κB活性,有效抑制氧化应激所致的NF-κB的过度表达,可阻止细胞因子诱导炎症介质基因表达,因此具有抗炎作用。新近研究表明,PDTC的生物学作用涉及多条信号转导途径。有研究证实PDTC可以通过PI3K/Akt信号途径使Akt的磷酸化水平增加。多项研究证实,PDTC可降低糖尿病大鼠血糖水平,但是对PDTC抗糖尿病的机制少有报道。本研究以高脂喂养加小剂量链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)腹腔注射的方法建立2型糖尿病大鼠模型,并用PDTC(50 mg·/kg体重)干预1周后,观察PDTC对糖尿病大鼠血糖及血脂代谢的影响,以及肝脏的保护作用;PDTC通过Akt/ FoxO1信号通路对肝糖异生影响以及PDTC通过Akt/ GSK/ GS信号通路对肝脏糖原合成的影响,探讨信号转导机制。实验内容主要包括以下4部分:第一部分:吡咯烷二硫代氨基甲酸酯对糖尿病大鼠糖脂代谢的影响目的:观察吡咯烷二硫代氨基甲酸酯对糖尿病大鼠血糖及血脂代谢的影响。方法:1动物模型建立、分组及标本处理参照Reed等方法建立2型糖尿病大鼠模型:雄性Wistar大鼠,随机分为两组,12只为正常对照组(normal control,NC组),喂普通饲料,37只为高脂饮食组(high-fat, HF组),喂高脂饲料。实验期间动物自由摄取食物和水,体重每周记录1次。喂养8周后,经口服葡萄糖耐量试验( oral glucose tolerance test, OGTT )和胰岛素耐量试验( insulin tolerance test,ITT)证实高脂饮食组产生胰岛素抵抗后,过夜禁食12小时,给予一次性腹腔注射链脲佐菌素27 mg/kg体重,对照组大鼠给予同体积柠檬酸缓冲液腹腔注射,3天后随机血糖≥16.7 mmol/L为2型糖尿病模型成功。共有36只大鼠成模,后随机分为三组,12只为糖尿病模型组(DM),12只为PDTC治疗组(DM+P),12只为胰岛素对照组(DM+INS)。PDTC治疗组给PDTC腹腔注射治疗(50 mg/kg体重),每天1次,连续治疗1周,正常对照组、DM和DM+INS组给同体积的生理盐水腹腔注射。治疗1周后,过夜禁食12小时,PDTC治疗组处死前1小时给PDTC(50 mg/kg)腹腔注射治疗,胰岛素组处死前1小时给胰岛素1 U/kg体重一次性腹腔注射,其它组给生理盐水腹腔注射。处死前用快速血糖仪检测尾静脉血糖,断头处死,留取血液及肝脏。2血糖、胰岛素的测定血糖采用葡萄糖氧化酶法测定,胰岛素采用ELISA法测定。应用稳态模型胰岛素抵抗指数(homeoestasis model assessment of insulin resistance,HOMA-IR)及胰岛素敏感指数(insulin sensitivity index,ISI)评价胰岛素抵抗的程度。HOMA-IR=(FBG×FINS)/22.5表示胰岛素抵抗的程度;ISI=1/(FBG×FINS),表示胰岛素敏感性,均使用自然对数表示。3口服葡萄糖耐量试验(OGTT)和胰岛素耐量试验(ITT)OGTT:以2 g/kg体重葡萄糖灌胃,分别测定0 min、30 min、60 min、90 min、120 min血糖及胰岛素水平。ITT:给予1 U/kg生物合成人胰岛素腹腔注射,分别测定各组大鼠0 min、15 min、30 min、60 min、90 min的血糖水平。4血脂的测定用全自动生化分析仪测定甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的水平,采用Cu2+比色法测定游离脂肪酸(FFA)的水平。结果:1两组大鼠空腹体重的比较实验开始时,随机分为正常对照组大鼠(NC组)和高脂饮食组(HF组),两组大鼠体重无统计学差异。喂养4周后,HF组大鼠体重(306.00±15.81 g)较NC组大鼠体重(252.90±27.80 g)增加明显(P<0.01)。喂养8周后,HF组大鼠体重(361.92±19.22 g)明显高于NC组(313.17±19.95 g)(P<0.01)。2两组大鼠空腹血糖、胰岛素含量、HOMA-IR和ISI的比较大鼠喂养8周后,HF组与NC组空腹血糖无统计学差异;HF组大鼠胰岛素水平(18.01±2.63μIU/ml)明显高于NC组大鼠(10.67±0.83μIU/ml)(P<0.05);HF组HOMA-IR(1.22±0.17)明显高于NC组(0.68±0.09)(P<0.05);HF组IS(I-4.43±0.17)明显低于NC组(-3.79±0.09)(P<0.05)。3两组大鼠OGTT和ITT的结果大鼠喂养8周后, OGTT结果显示:HF组大鼠各时间点血糖水平均较NC组明显升高,其中90 min、120 min两个时间点血糖水平比较,有显著性差异(P<0.05);HF组大鼠各时间点胰岛素水平较NC组均明显升高(P<0.05)。ITT结果显示:HF组大鼠腹腔注射胰岛素后15 min、60 min、90 min三个时间点血糖水平明显高于NC组(P<0.05)4造模及治疗后各组大鼠血糖的比较大鼠注射STZ 72 h后,DM组大鼠空腹血糖(26.16±3.38 mmol/L)明显高于NC组(4.41±0.56 mmol/L)(P<0.01)。PDTC治疗1周后,DM组大鼠空腹血糖(26.55±2.90 mmol/L)仍明显高于NC组(5.58±0.43 mmol/L)(P<0.01);PDTC治疗组大鼠空腹血糖(11.55±2.89 mmol/L)较DM组明显降低(P<0.01)。5治疗后各组大鼠血脂的比较DM组大鼠的TC(8.79±1.83 mmol/L)、TG(1.12±0.31 mmol/L)、LDL(1.72±0.28 mmol/L)、FFA(1.82±0.14 mEq/L),均明显高于NC组TC(2.18±0.11 mmol/ L)、TG(0.66±0.07 mmol/L)、LDL(1.10±0.07 mmol/L)、FFA(1.27±0.13 mEq/L),(均P<0.05);PDTC治疗组TG(0.70±0.10 mmol/L)与DM组比较,明显降低(P<0.05);其它血脂水平均无明显改善(P>0.05)。结论:1通过高脂饮食可造成大鼠对胰岛敏感性降低,再给予小剂量链脲佐菌素腹腔注射,可成功制备2型糖尿病大鼠模型。2 PDTC能够降低糖尿病大鼠血糖水平,对血脂无明显作用。第二部分:吡咯烷二硫代氨基甲酸酯对糖尿病大鼠肝糖原合成的影响及机制目的:探讨吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(PDTC)对糖尿病大鼠肝糖原合成的影响及机制。方法:取大鼠肝脏组织,以KOH碱液煮沸溶解,用蒽酮比色法测定大鼠肝脏中糖原含量;在液氮中研磨粉碎大鼠肝脏组织,提取组织中蛋白,Western blot检测大鼠肝脏中蛋白激酶B(PKB/Akt)和糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)磷酸化水平的变化。结果:1 PDTC对糖尿病大鼠肝糖原合成的影响DM组大鼠肝糖原含量(5.92±0.99 mg/g)与NC组(11.59±1.96 mg/g)相比明显减少,有显著性差异(P<0.01),经过药物干预后,DM+P组(8.77±1.00 mg/g)和DM+INS组(10.25±1.76 mg/g)肝糖原含量增加较DM组肝糖原含量均明显增加(均P<0.01)。2 PDTC对糖尿病大鼠肝组织Akt磷酸化水平的影响DM组大鼠Akt磷酸化水平(0.43±0.05)与NC组(0.94±0.07)比较明显降低(P<0.01),经过药物干预后,DM+P组(1.23±0.10)和DM+INS组(1.43±0.11)Akt磷酸化水平与DM组相比均有明显增加(均P<0.01)。3 PDTC对糖尿病大鼠肝组织GSK-3β磷酸化水平的影响DM组GSK-3β磷酸化水平(0.40±0.04)与NC组相比明显降低(0.64±0.07)(P<0.01),经过药物干预后,DM+P组(0.78±0.05)和DM+INS组(0.84±0.03)GSK-3β磷酸化水平与DM组相比均有明显增加(均P<0.01)。结论:PDTC可使2型糖尿病大鼠肝脏中蛋白激酶B(Akt)和糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)磷酸化水平增加。PDTC通过调控Akt/GSK-3β活性,增加肝糖原合成,降低血糖。第三部分:吡咯烷二硫代氨基甲酸酯对糖尿病大鼠肝糖异生的影响及机制目的:探讨吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(PDTC)对糖异生酶基因表达的影响,及其影响肝脏糖异生的信号转导机制。方法:取大鼠肝脏组织,液氮中研磨粉碎,提取组织蛋白及RNA,Western blot分析大鼠肝脏中FoxO1磷酸化水平的变化;Real time-PCR检测肝脏PEPCK及G6Pase的mRNA表达量的变化;用OCT胶包埋肝脏组织,冰冻切片机切片,经免疫荧光染色,通过激光共聚焦显微镜观察FoxO1在细胞浆与细胞核分布的改变。结果:1 PDTC对糖尿病大鼠肝组织FoxO1活性的影响DM组FoxO1磷酸化水平(0.06±0.01)与NC组(0.77±0.06)相比明显降低(P<0.01),经过药物干预后,DM+P组(0.64±0.07)和DM+INS组(0.71±0.07)FoxO1磷酸化水平与DM组相比均有明显增加(均P<0.01)。2 PDTC对糖尿病大鼠肝组织中FoxO1细胞亚定位的影响共聚焦显微镜显示,DM组大鼠肝细胞胞浆中FoxO1水平较NC组明显降低,DM+P组和DM+INS组胞浆中FoxO1水平较DM组大鼠明显增加。3 PDTC对糖尿病大鼠肝组织中肝糖异生酶PEPCK和G6Pase的影响DM组大糖异生酶PEPCK(1.77±0.32)和G6Pase mRNA(3.20±0.76)相对表达量与NC组PEPCK(1.04±0.19)和G6Pase mRNA(1.02±0.08)比较明显升高(均P<0.01),经过药物干预后,DM+P组PEPCK(0.87±0.19)、G6Pase(0.82±0.18)和DM+INS组PEPCK(0.51±0.13)、G6Pase(0.62±0.11)mRNA相对表达量与DM组相比明显降低(均P<0.01)。结论:PDTC通过Akt/FoxO1信号途径,使FoxO1发生磷酸化。磷酸化的FoxO1发生核浆转位,使PEPCK及G6Pase mRNA生成减少,减少肝脏糖异生,进而降低血糖。第四部分:吡咯烷二硫代氨基甲酸酯对糖尿病大鼠的肝脏保护作用目的:观察吡咯烷二硫代氨基甲酸酯对糖尿病大鼠肝脏损伤的保护作用,以及其机制。方法:取大鼠肝脏组织,液氮中研磨粉碎,提取组织中RNA,应用RT-PCR检测肝组织中诱生型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA的表达量。大鼠肝脏组织经10%福尔马林溶液固定24 h后,石蜡包埋后制备组织切片,用HE染色及iNOS、NT组化染色,观察大鼠肝脏损伤情况。结果:1肝脏组织大体观及HE染色结果HE染色结果:NC组肝细胞形态正常,肝小叶结构清晰完整;DM组大鼠与NC组比较,肝脏明显脂肪变性,肝细胞边界不清,细胞排列紊乱,肝小叶结构模糊不清。DM+P组肝细胞形态恢复正常,肝小叶结构尚清,脂肪变性及肝细胞损伤明显减轻。2诱生型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA的表达DM组(1.29±0.12)iNOS mRNA的表达较NC组(0.19±0.03)明显升高(P<0.01),DM+P组iNOS mRNA的表达量(0.22±0.04)较DM组明显降低(P<0.01)。3免疫组化观察各组大鼠肝脏中iNOS、NT的表达在DM组大鼠中,iNOS的表达水平和NT的生成明显高于NC组;在DM+P组iNOS的表达水平和NT的生成明显低于DM组。结论:高糖条件下诱发氧化应激,iNOS表达及NT生成增多,在肝脏损伤起着重要作用。PDTC通过减少iNOS表达及NT生成,从而对2型糖尿病肝损伤发挥保护作用。
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