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研究目的1,2-二氯乙烷(1,2-DCE)是一种有机溶剂,因具有性能好、价格低等特点使其在工业上应用广泛。1,2-DCE易经多种途径进入人体,职业接触主要经呼吸道吸入而发生中毒事故。现有研究主要集中在1,2-DCE致神经系统、肝肾系统、呼吸系统的毒性作用,而目前关于1,2-DCE暴露致雄性生殖毒性研究甚少,中毒机制不详。为了揭示1,2-DCE诱导的雄性生殖毒性并阐明其潜在的毒性机制,本研究目的通过吸入暴露建立动物模型来模拟1,2-DCE职业暴露,探索1,2-DCE致雄性生殖毒性及其致病机制。研究方法1.构建1,2-DCE亚急性雄性生殖毒性动物模型采用全身动式吸入染毒方式进行1,2-DCE暴露实验,选用雄性NIH小鼠,SPF级,7周龄,200只,将其按体质量随机分为4组,分别给予0、100、350、700 mg/m~3的1,2-DCE染毒剂量,6 h/d,每周连续染毒7 d。动物模型主要分3个部分,第1部分80只小鼠用于1,2-DCE的血液动力学试验,检测小鼠的血液、尿液内暴露浓度;第2部分60只小鼠用于1周暴露实验;第3部分60只小鼠用于4周暴露实验。在实验期间,严格进行质量控制,每天监测染毒柜内温度、湿度、氧气、二氧化碳、氨气和气溶胶粒径。2.检测1,2-DCE亚急性雄性生殖毒性染毒结束后,分析各剂量组雄性NIH小鼠的体重变化,称量并计算睾丸脏器系数;对睾丸、附睾组织进行病理学检查;检测附睾内精子的常规参数、畸型率和精子细胞损伤情况;采用ELISA法对小鼠血浆和睾丸组织匀浆液中的睾酮合成相关激素水平进行检测分析。3.1,2-DCE致雄性生殖毒性分子机制研究采用qRT-PCR与蛋白质印迹分别检测睾酮合成关键酶、CREM/CREB信号通路分子和细胞凋亡信号通路分子的基因和蛋白质表达水平。采用TUNEL荧光染色法定量分析睾丸生精细胞凋亡水平,采用TUNEL DAB染色法定性分析睾丸凋亡的细胞和阶段特异性。研究结果1.1,2-DCE亚急性雄性生殖毒性动物暴露染毒期间,对照组和低、中、高剂量组的1,2-DCE染毒质量浓度分别为0.30±0.10、102.70±7.05、356.04±20.45和707.01±39.33mg/m~3;温度、湿度、氧气、二氧化碳和气溶胶粒径等实验质量控制数据差异均无统计学意义(P>0.05)。2.1,2-DCE亚急性雄性生殖毒性表现1,2-DCE亚急性暴露第4周,高剂量组小鼠的体质量下降,睾丸脏器系数升高;睾丸生精上皮细胞数量减少,呈空泡化;附睾内精子减少。同时,高剂量组小鼠的精子浓度在染毒第1周和第4周均减少(P<0.05);在染毒第1周和第4周,低、中、高3个剂量组小鼠的精子畸型率均增加(P<0.05)。中和高剂量组小鼠的睾酮、黄体生成素在血浆和睾丸组织中的水平均在染毒第4周升高(P<0.05);睾丸组织的促性腺激素释放激素和环磷酸腺苷在染毒第4周水平均升高(P<0.05)。3.1,2-DCE致雄性生殖毒性分子机制低、中、高3个剂量组小鼠黄体生成素受体的基因和蛋白质表达水平均在染毒第4周升高(P<0.05)。1,2-DCE亚急性暴露抑制CREM/CREB信号通路。CREM、CREB及其上游调控因子ACT、TORC1和下游靶因子LDH-C、TESK1的基因和蛋白表达水平均减少(P<0.05)。此外,通过TUNEL分析显示1,2-DCE亚急性暴露引起睾丸生精细胞凋亡增加,且凋亡无细胞和阶段特异性。促凋亡分子p53和Bax表达升高,抗凋亡分子Bcl-2表达减少,导致了caspase 3表达升高,进而引起睾丸凋亡。研究结论1.1,2-DCE亚急性动式吸入暴露引起雄性NIH小鼠生殖毒性。2.1,2-DCE通过抑制CREM/CREB信号通路,诱导促凋亡分子p53、Bax的表达和抑制抗凋亡分子Bcl-2的表达,引起睾丸生精细胞凋亡,进而引起睾丸损伤。