糖尿病是一种以高血糖为特征的代谢性疾病,与心脑血管疾病和肿瘤共同成为人类的“三大健康杀手”。目前,中国已成为糖尿病患者最多的国家,其中II型糖尿病约占发病率的95%以上,并呈现低龄化、病死率增多的快速增长趋势。在自然界中,黄酮类化合物主要来源于植物的次生代谢产物,通常具有苯并色原酮的基本母核,已发现的黄酮类化合物达4000多种,其结构复杂多变,具有多种药理活性,如抗氧化、抑制肿瘤细胞生长、降血糖、降血压、抑菌和防治呼吸系统疾病等。黄酮类化合物是桑根皮中的重要活性成分之一,具有降血糖作用,且效果显著,但其作用机制尚不明确。因此,深入探讨桑根皮黄酮类化合物降血糖的作用机制,可为开发良好的降血糖药物提供重要的理论参考价值。本研究从桑根皮总黄酮的提取工艺出发,考察提取时间、乙醇体积浓度和原料质量浓度三个对桑根皮总黄酮提取率影响较大的因素进行交互影响和分析;进一步对桑根皮提取物进行硅胶柱层析,分离纯化,并利用HPLC对黄酮化合物进行分析,建立HPLC指纹图谱;在此基础上,对所得的桑根皮不同部位和单体化合物进行体外酶抑制活性筛选;最后通过3T3-L1前脂肪细胞建立的胰岛素抵抗模型探讨桑根皮总黄酮的降血糖作用机制,为研制桑根皮总黄酮的降血糖药物提供理论支持和技术参考。主要研究结果如下:1、桑根皮总黄酮提取工艺优化:选取塘10品种的桑根皮作为原材料,选取提取时间、乙醇体积浓度和原料质量浓度作为单因素条件,利用超声波辅助提取,以Box-Benhnken中心组合试验设计法优化提取工艺条件,桑根皮总黄酮得率为响应值,建立回归模型,采用Design-Expert软件对实验结果进行回归分析,确定超声波辅助提取桑根皮总黄酮最佳工艺条件为:提取时间1.66h,原料质量浓度0.04g/ml,乙醇体积分数79.70%。实际操作时将其修正为提取时间1.6h,原料质量浓度0.04g/ml,乙醇体积分数80.0%。采用此优化的工艺条件提取桑根皮总黄酮的得率达到3.63%,预测值为3.71%。采用响应面分析法优化桑根皮总黄酮的提取工艺条件具有较好的实际应用价值,为桑根皮功能性成分的研究奠定了一定的原料基础。2、桑根皮提取分离及hplc分析:利用硅胶柱层析、制备型hplc等手段对桑根皮提取物进行分离纯化,得到4个单体化合物,鉴定其为熊果酸、β-谷甾醇、桑根皮素和白桦脂酸;同时,对桑根皮总黄酮提取物进行极性分部萃取,分别得到石油醚萃取相、乙酸乙酯萃取相、正丁醇萃取相和水相等不同极性部位,运用hplc对桑根皮黄酮提取物进行指纹图谱分析,比较分析桑根皮中黄酮单体含量,结果发现含量最多的是山奈素,其次是桑根皮素和桑皮黄素,最少的是异槲皮苷和桑黄酮e。通过此部分实验,为桑根皮黄酮hplc指纹图谱的研究奠定理论依据,也为后期体外酶活性筛选提供样品。3、体外降血糖活性评价:以桑根皮中得到的4个单体化合物和不同极性萃取部位为试验样品,综合考察其体外α-葡萄糖苷酶抑制活性、蔗糖酶抑制活性、ptp1b酶抑制活性,以及dpph自由基清除能力和frap体外抗氧化能力。结果表明,从桑根皮中所获得的样品对三种血糖相关酶均有一定抑制作用,但抑制能力强弱存在差异。桑根皮黄酮粗提物、乙酸乙酯萃取相和桑根皮素抑制效果明显,且同时对两种酶(α-葡萄糖苷酶和ptp1b酶)表现出显著性抑制作用;而在抗氧化活性评价中,正丁醇萃取相同时表现出强的dpph自由基清除能力和总抗氧化能力(frap),桑根皮粗提物和乙酸乙酯萃取相表现出较强的总抗氧化能力(frap)。4、桑根黄酮降血糖作用机制初探:利用3t3-l1前脂肪细胞建立胰岛素抵抗模型,考察桑根黄酮对脂肪细胞增殖分化的影响,以及其对pi3k-akt信号通路中关键因子pparγ、ir、pi3k、akt、glut-4、ptp1b的基因表达和蛋白表达的调控作用。结果显示,与模型组相比,桑根黄酮能改善3t3-l1脂肪细胞胰岛素抵抗,上调pparγ、ir、pi3k、akt、glut-4基因表达水平,下调ptp1b基因表达水平,而对蛋白表达的影响并未与基因表达呈现一致性,推测可能与基因片段的内含子与外显子及转录后调控等因素有关。综上所述,桑根黄酮降血糖效应可能与pi3k-akt信号通路的激活有关。