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目的:分析各种虫媒病毒的公共卫生学意义及其在贵州的传播风险,筛选出部分病毒作为监测对象,并基于TaqMan RT-PCR技术,建立出适合贵州省的快速、灵敏、特异的虫媒病毒检测方法。为贵州省重要病媒生物防控及病原检测技术平台建设提供技术支持。方法:1.查阅相关文献确定需要监测的虫媒病毒后,通过GenBank数据库获得各病毒的全基因序列,使用Bioedit软件对各病毒的全基因序列进行比对分析,找到高度保守区域,利用NCBI blast及DNAStar中primer select等软件辅助手动设计引物及TaqMan探针,并对多重组合中的多对引物探针的相互影响进行评价。2.运用体外转录方法合成靶基因的RNA模板,并以制备的RNA标准品为模板进行单重荧光定量RT-PCR检测,建立标准曲线,评价各体系的灵敏度及重复性;将所有病毒的引物-探针对之间做交叉反应试验,以评价各体系的特异性。3.在单重荧光定量RT-PCR的基础上,查阅文献,根据病毒所致疾病类型与种属分类情况将10种病毒初步分成三组,根据组合信息,在同一体系中同时加入多种引物探针,对多重荧光定量RT-PCR反应体系进行摸索,并通过对退火温度、引物探针浓度等条件的摸索来改善多重体系中非特异条带的情况。4.根据病毒TaqMan探针的标记,将所有病毒做交叉实验进行2重实时荧光RT-PCR检测,根据实验结果筛选出可行的双重荧光定量RT-PCR组合。5.针对筛选出的两组可行组合,利用RNA标准品进行双重荧光定量RT-PCR检测,建立标准曲线,评价各体系的灵敏度及重复性;利用体外转录合成的病毒RNA和感染DENV-2的蚊虫样本RNA对方法的实用性及特异性进行初步评价。结果:1.确定10种黄病毒科黄病毒属中影响较严重的虫媒病毒为主要监测对象。2.制备了10种病毒的RNA标准品。3.绘制了10种虫媒病毒单重实时荧光定量RT-PCR检测体系的标准曲线:Ct值与起始模板拷贝数的对数相关性都达到0.99以上,扩增效率在87.20%~102.00%之间。各体系的灵敏度、重复性、特异性检测结果表明:灵敏度在101~102 copies/μL,组内变异系数小于3%;10种病毒的引物-探针对之间做交叉反应验证,各引物-探针对与其他病毒均无明显扩增。4.建立了DENV-2/DENV-3和JEV/WNV两组双重荧光定量RT-PCR检测体系的标准曲线:Ct值与起始模板拷贝数的对数相关性都达到0.99以上,扩增效率在83.6%-98.06%之间。两组双重实时荧光体系的灵敏度、特异性、重复性检测结果表明:灵敏度在102-103copies/μL之间,组内变异系数最大为3.00%;利用体外转录的病毒RNA样本和蚊虫样本对建立的2组双重实时荧光RT-PCR方法的特异性进行初步评价,结果表明:DENV-2/DENV-3的双重实时荧光体系能特异的检测出被DENV-2感染上的蚊子。运用体外转录的病毒RNA对建立的两组双重实时荧光方法进行检测,仅DENV-2、DENV-3、JEV、WNV四种病毒RNA被检测到。结论:1.成功建立了DENV-1/DENV-2/DENV-3/DENV-4、JEV、WNV、TEBV、MVEV、KFDV、YFV这10种虫媒病毒的单重实时荧光定量RT-PCR体系,经过检验,体系的灵敏度均达到102copies/μL,扩增效率高,重复性及特异性好。2.成功建立了DENV-2/DENV-3/、JEV/WNV这4种虫媒病毒的双重实时荧光定量RT-PCR检测体系,经过检验,除DENV-2/JEV灵敏度只达到103copies/μL外,体系的灵敏度均达到102copies/μL,仍具有较高的灵敏度。体系的扩增效率高,重复性及特异性好。后续研究需对反应体系进行进一步的优化,希望能够提高反应的灵敏度与扩增效率。希望以本研究为基础,在后续实验中能达到对虫媒病毒的多重检测。3.利用体外转录的病毒RNA、蚊虫样本对所建立的JEV/WNV、DENV-2/DENV-3双重实时荧光定量RT-PCR体系进行检测,可快速、准确地检测感染DENV-2蚊虫样本,说明本研究建立的双重体系有望为这几种病毒的快速、准确的多重鉴别诊断提供一种可能的方法。