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梭链孢烷抗生素是一类来源于真菌的,在原萜烯醇（Protostadienol）的基础上通过脱去C-4β甲基,C-16β位连接乙酰氧基,C-20位甲基氧化成羧基等一系列反应形成的具有抗革兰氏阳性菌活性的四环三萜化合物,其代表性的化合物有三个,分别是烟曲霉酸（Helvolic acid,1）,夫西地酸（Fusidic acid）与头孢菌素P1（Cephalosporin P1）。其中,夫西地酸的活性最为突出,目前已在临床上用于治疗细菌性皮肤病等。研究人员通过化学方法及生物转化方法对梭链孢烷抗生素进行了一系列的结构改造,但至今尚未获得具有更强抗菌活性的类似物。组合生物合成技术已成为丰富化合物多样性,获取结构新颖化合物的一个重要手段,其成功运用的关键在于阐明目标化合物的生物合成途径,但目前梭链孢烷抗生素的生物合成途径仍不清楚。2009年,东京大学药学院阿部教授课题组从Aspergillus fumigatus af293的基因组信息中发现了一个含有九基因的基因簇,包括一个环化酶基因helA,四个P450氧化酶基因helB1-4,一个短链脱氢还原酶基因helC,两个乙酰转移酶基因helD1-2以及一个甾酮脱氢酶基因helE,并推测这个基因簇可能负责烟曲霉酸的生物合成。他们利用酵母表达系统对其中的三个基因进行了初步研究,发现环化酶HelA可将2,3-环氧角鲨烯环化形成原萜烯醇（2）,短链脱氢还原酶HelC负责原萜烯醇C-3β羟基脱氢形成羰基,P450氧化酶Hel B1可将原萜烯醇C-4β甲基氧化成羧基。然而,烟曲霉酸的生物合成依然存在很多问题有待于解决:首先,文献推测的含有九基因的基因簇是否就是完整的烟曲霉酸的生物合成基因簇;如果是,基因簇中剩余六个未知基因如何发挥修饰作用;其次,在烟曲霉酸的生物合成中是否存在比烟曲霉酸抗菌活性更强的化合物。因此,系统地开展烟曲霉酸的生物合成研究,将为全面揭示梭链孢烷抗生素的生物合成机制,以及为通过组合生物合成技术获取活性更为突出的梭链孢烷抗生素奠定基础。本研究首先采用四营养缺陷的米曲霉Aspergillus oryzae NSAR1作为异源表达宿主,将基因簇中的九个基因全部导入到米曲霉中,结果从含有九基因的转染菌株的代谢产物中分离获得了烟曲霉酸（1）,从而证明文献推测的含有九基因的基因簇就是烟曲霉酸的生物合成基因簇。随后我们在米曲霉系统中采用基因逐步导入的方法系统地阐明了烟曲霉酸的生物合成途径,如图1所示:首先,环化酶HelA将2,3-环氧鲨烯环化形成原萜烯醇（2）;接着,短链脱氢还原酶HelC将化合物2的C-3β羟基氧化成羰基生成化合物3,同时P450氧化酶HelB1将化合物2的C-4β甲基氧化成羧基生成化合物4;HelC与HelB1共同作用形成脱甲基产物5;随后,P450氧化酶HelB2氧化C-16形成含有C-16β羟基的化合物6和7;乙酰转移酶HelD2将C-16β羟基乙酰化形成化合物10与13;P450氧化酶HelB4将C-20甲基氧化成羧基形成化合物16与17;在此之后,P450氧化酶HelB3氧化化合物16的C-6与C-7分别形成C-6β羟基与C-7羰基从而形成化合物19;乙酰转移酶HelD1将C-6β羟基乙酰化形成化合物21;最后甾酮脱氢酶HelE使化合物21的C-1与C-2脱氢形成双键从而形成了烟曲霉酸（1）。基于以上结果,我们揭示了基因簇中剩余六个基因的功能及作用顺序。在烟曲霉酸的生物合成研究中,我们发现HelC可能作用于多个底物。由于其宽泛的底物适应性,HelC有望成为一种新的酶催化工具。因此我们对其功能进行了体外酶催化验证。我们利用E.coli BL21（DE3）表达了N端连有6×His的重组HelC,并通过亲和柱色谱纯化了HelC蛋白。我们发现HelC在辅酶NAD+的参与下可以作用于多个同时含有C-3β羟基与C-4β羧基的底物4,6,10与17,使得C-3β羟基脱氢生成羰基,从而引发氧化脱羧反应形成相应的产物5,7,13与16。除此之外,对于只含有C-3β羟基的化合物15,18与20,HelC也可将其氧化成相应的产物16,19与21。另外,我们还发现HelC在NADH的参与下还可将含有C-3羰基的16,19与21特异性地还原为含有C-3β羟基的15,18与20。目前,在三萜及甾体合成研究中,从未有能够催化C-3β羟基与C-3羰基可逆互变的短链脱氢还原酶。基于体外酶催化反应实验,我们已经证明化合物5,7与16可由HelC催化形成,因此我们推测合成化合物5,7与16的另一条途径可能不存在。为此,我们将P450氧化酶HelB1,HelB2与HelB4分别导入到A.oryzae NSAR1中,通过喂养实验进行了验证。结果显示P450氧化酶表达菌株无法将含有C-3羰基的底物3,5与13分别转化成5,7与16（图1）,说明HelB1,HelB2与HelB4无法作用于含有C-3羰基的底物。在利用米曲霉表达体系研究烟曲霉酸生物合成机制的过程中,我们分离获得了包括烟曲霉酸在内的25个相关产物,其中有16个是新化合物。通过二倍稀释法,我们对分离获得的化合物进行了抗Staphylococcus aureus 209P活性评价,结果显示多数化合物呈现良好的抗金黄色葡萄球菌活性,其中化合物19,22与23的抗菌活性甚至强于烟曲霉酸,特别是化合物23,其最小抑菌浓度（MIC）达到了0.5μg/mL。通过进一步构效关系分析,我们发现化合物16的抗菌活性要远远强于化合物13,说明C-20位上的羧基对梭链孢烷抗生素的抗菌活性至关重要,这与文献报道的结果一致。另外我们还发现含有C-3羰基的16,19与21的抗菌活性显著强于含有C-3β羟基的15,18与20,说明C-3羰基取代比C-3β羟基取代更有利于梭链孢烷抗生素的抗菌活性,这也与文献报道的结果一致。除此之外,我们还首次发现C-6β羟基的乙酰化会抑制化合物的抗菌活性:与烟曲霉酸相比,6β-羟基未乙酰化的化合物23具有更强的抗菌活性;同样,21的抗菌活性也低于化合物19的活性。利用米曲霉异源表达体系,我们首次系统地揭示了烟曲霉酸的生物合成途径,为利用组合生物合成技术获取具有更高活性的梭链孢烷抗生素奠定了基础。通过体外酶催化反应,我们发现短链脱氢还原酶HelC具有宽泛的底物适应性以及多种催化功能,可作为一种潜在的酶工具用于天然产物的生物转化。此外,我们在烟曲霉酸的生物合成中发现了比烟曲霉酸抗金黄色葡萄球菌活性更强的化合物,为未来改造合成新型梭链孢烷抗生素提供了新的思路。