实验目的:肺炎链球菌（S.Pneumoniae,SP）是目前细菌性脑膜炎最常见和最主要的致病菌之一。细菌性脑膜炎是儿童时期严重的中枢神经系统感染性疾病,其中SP脑膜炎病例数占细菌性脑膜炎病例总数的半数以上。近年来,尽管及时给予有效的抗生素等综合治疗,SP脑膜炎仍存在较高的死亡率,近半数的幸存者遗留听力或视觉损害、癫痫、认知障碍等神经系统后遗症。因此,进一步研究细菌性脑膜炎的免疫病理机制,寻找新的免疫干预手段意义重大。已知细菌性脑膜炎中过度强烈的免疫炎症反应可以造成血脑屏障破坏、脑水肿及脑组织损伤,而脑组织损伤的程度决定了细菌性脑膜炎患者的预后。研究表明,细菌性脑膜炎脑脊液（CSF）中的促炎症因子,包括肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）、C反应蛋白（C-reactive protein,CRP）、白细胞介素-6（Interleukin-6,IL-6）、单核细胞趋化因子蛋白-1（Monocyte chemotactic protein-1,MCP-1）等的释放导致了蛛网膜下腔的炎症反应,并可能与脑膜炎的发展过程和死亡率密切相关,这提示脑内的这些促炎症因子在细菌性脑膜炎的免疫损伤过程可能具有重要作用。髓样相关蛋白8（Myeloid-related Proteins 8,MRP8）和14,又名S100A8和S100A9,是中性粒细胞（Polymorphonuclear Neutrophils,PMNs）和单核细胞等细胞中表达量最大的胞浆蛋白,和固有免疫功能密切相关。MRP8和MRP14主要以异源二聚体形式MRP8/14存在,又名钙卫蛋白（Calprotectin）,主要表达于粒细胞、单核细胞、早期分化阶段的巨噬细胞以及成纤维细胞和微血管内皮细胞等。近年来,MRP8/14在感染性疾病领域的研究引起了广泛的关注。研究表明,在关节炎、多发性硬化、系统性红斑狼疮、炎症性血管炎以及炎症性肠病中,血清MRP8/14浓度显著升高,并且增高的MRP8/14浓度与这些疾病的活动性及其他炎症参数,如CRP和红细胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate,ESR）等存在正相关关系。本研究通过体内实验分析MRP8/14对SP脑膜炎动物模型中促炎症因子TNF-α、CRP、IL-6、MCP-1表达的影响,探讨MRP8/14在细菌性脑膜炎免疫炎症反应中的调控作用及其机制,以期为寻找细菌性脑膜炎新的免疫干预靶点提供新的思路和实验依据。实验方法:1、体内实验,研究MRP8/14对SP脑膜炎小鼠的神经行为学评分、体质量的变化、脑水肿的程度、脑组织匀浆及血清中促炎症因子TNF-α、CRP、IL-6、MCP-1的水平及mRNA相对表达量等的影响。取周龄为8周左右的健康雄性BALB/C小鼠48只,随机分为4组:磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline,PBS）对照组、MRP8/14蛋白组、SP组、SP+MRP8/14蛋白组;每组12只小鼠。腹腔注射麻醉后,侧脑室穿刺注射40ulPBS+5ulSP混悬液建立小鼠SP脑膜炎模型;PBS组注射45ulPBS,MRP8/14组注入40ul浓度为0.5ug?ul^-11 MRP8/14蛋白+5ulPBS,SP组注入40ulPBS+5ulSP混悬液,SP+MRP8/14组注入40ul浓度为0.5ug?ul^-1的MRP8/14蛋白+5ulSP混悬液。2、注射后6h、24h、48h对各组小鼠检测:1)神经行为学评分;2)体质量变化量;3)脑水肿测定;4)HE染色查看脑组织炎症;5)Real-time PCR检测脑组织中促炎症因子TNF-α、CRP、IL-6、MCP-1的mRNA相对表达量;6)ELISA检测脑组织及血清中促炎症因子TNF-α、CRP、IL-6、MCP-1的浓度;7)免疫组化检测大脑中NF-κB p65的表达。实验结果:一、MRP8/14对SP脑膜炎小鼠临床症状的影响1、神经行为学评分:分别记录各组小鼠侧脑室注射后6h、24h、48h时的神经行为学评分。MRP8/14组与PBS组小鼠的神经行为评分:6h（5.0±0）vs（5.0±0）、24h（4.75±0.5）vs（5.0±0）、48h（5.0±0）vs（5.0±0）,差异均无统计学意义（P>0.05）;SP组与PBS组小鼠的神经行为评分:6h（5.0±0）vs（5.0±0）、24h（3.75±0.5）vs（5.0±0）、48h（3.25±0.96）vs（5.0±0）,24h及48h的差异具有统计学意义（P<0.05）;SP+MRP8/14组在24h、48h的评分均明显低于PBS组:6h（4.94±0.25）vs（5.0±0）、24h（2.5±0.58）vs（5.0±0）、48h（1.25±0.96）vs（5.0±0）,差异具有统计学意义（P<0.01）,且SP+MRP8/14组在24h、48h的评分与SP组相比进一步降低:6h（4.94±0.25）vs（5.0±0）、24h（2.5±0.58）vs（3.75±0.5）、48h（1.25±0.96）vs（3.25±0.96）,差异具有统计学意义（P<0.05）。2、体质量变化:分别记录各组小鼠侧脑室注射后6h、24h、48h的体质量减少量。MRP8/14组与PBS组小鼠在6h、24h、48h后的体质量变化:6h（0.5±0.98）vs（0.52±0.13）g、24h（1.02±0.42）vs（1.26±0.50）g、48h（1.60±0.55）vs（1.29±0.52）g,无统计学意义（P>0.05）;SP组注射细菌后24h、48h时体重较PBS组均降低:6h（0.62±0.85）vs（0.52±0.13）g、24h（1.99±0.17）vs（1.26±0.50）g、48h（2.19±0.18）vs（1.29±0.52）g,24h、48h有统计学意义（P<0.05）;SP+MRP8/14组体重明显低于PBS组:6h（0.65±0.59）vs（0.52±0.13）g、24h（2.62±0.44）vs（1.26±0.50）g、48h（3.30±0.63）vs（1.29±0.52）g,24h、48h（P<0.05）,SP+MRP8/14组与SP组的体质量变化:6h（0.65±0.59）vs（0.62±0.85）g、24h（2.62±0.44）vs（1.99±0.17）g、48h（3.30±0.63）vs（2.19±0.18）g,24h及48h有统计学意义（P<0.05）。3、脑水肿测定:PBS组与MRP8/14组小鼠脑水肿无显著差异6h（77.28±0.46）vs（77.81±0.35）%、24h（76.81±0.89）vs（77.20±0.37）%、48h（76.36±0.69）vs（77.61±0.94）%,SP组在24h、48h脑水肿较PBS组升高6h（78.10±0.86）vs（77.28±0.46）%（P>0.05）、24h（79.16±0.81）vs（76.81±0.89）%、48h（82.28±0.49）vs（76.36±0.69）%,有统计学意义（P<0.05）;SP+MRP8/14组小鼠在24h、48 h脑水肿较PBS组升高,24h（81.62±0.83）vs（76.81±0.89）%、48h（87.91±0.92）vs（76.36±0.69）%,有统计学意义（P<0.05）,且与SP组相比降低明显24h（81.62±0.83）vs（79.16±0.81）%、48h（87.91±0.92）vs（82.28±0.49）%,有统计学意义（P<0.05）。4、脑组织HE染色:SP注射后6h时,SP组较PBS组,蛛网膜下腔稍扩张,软脑膜血管稍充血,脑膜及蛛网膜下腔偶及炎症细胞浸润;SP+MRP8/14组较SP组,蛛网膜下腔扩张明显,软脑膜血管充血明显,脑膜及蛛网膜下腔可及浸润的炎症细胞。SP注射后24h时,SP组较PBS组,蛛网膜下腔扩张,软脑膜充血,脑膜及蛛网膜下腔可及炎症细胞;SP+MRP8/14组较SP组,蛛网膜结构受破坏,软脑膜充血更明显,蛛网膜下腔及脑膜可及大量炎症细胞。SP注射后48h时,SP组较PBS组,蛛网膜下腔显著扩张,软脑膜充血较前明显,蛛网膜下腔及脑膜可及炎症细胞,SP+MRP8/14组相对于SP组,蛛网膜结构完全被破坏,蛛网膜下腔开放,软脑膜充血更显著,蛛网膜下腔及脑膜炎症细胞浸润加剧。5、脑组织匀浆Real-time PCR检测TNF-α、CRP、IL-6、MCP-1 mRNA的相对表达量:1)SP注射6h后,SP组TNF-αmRNA较PBS组明显升高（0.003386±0.0024）vs（0.000849±0.0005）,有统计学意义（P<0.05）;SP+MRP8/14组与SP组相比稍升高（0.004229±0.0031）vs（0.003386±0.0024）,无统计学意义（P>0.05）;24h时SP组较PBS组明显升高（0.00876±0.0044）vs（0.000847±0.00025）,差异有统计学意义（P<0.05）,SP+MRP8/14组与SP组相比明显升高（0.0281±0.00806）vs（0.00876±0.0044）,有统计学意义（P<0.05）;48h时SP组较PBS组明显升高（0.0135±0.00582）vs（0.000762±0.0002）,差异有统计学意义（P<0.05）,SP+MRP8/14组与SP组相比显著升高（0.0447±0.03）vs（0.0135±0.00582）,有统计学意义（P<0.05）。2)SP注射后6h,SP组CRP mRNA较PBS组升高（0.000995±0.0005）vs（0.000841±0.0005）,无统计学意义（P>0.05）,SP+MRP8/14组与SP组相比升高（0.001088±0.0008）vs（0.000995±0.0005）,无统计学意义（P>0.05）;24h时SP组较PBS组升高明显（0.001248±0.0007）vs（0.000577±0.0001）,（P<0.05）,SP+MRP8/14组与SP组相比升高（0.003416±0.014）vs（0.001248±0.0007）,（P<0.05）;48h时SP组较PBS组明显升高（0.002263±0.0008）vs（0.000538±0.0001）,（P<0.05）,SP+MRP8/14组与SP组相比升高显著（0.004476±0.0025）vs（0.002263±0.0008）,（P<0.05）。3)SP注射后6h,SP组IL-6 mRNA较PBS组升高（0.0063±0.006）vs（0.0003±0.002）,差异有统计学意义（P<0.05）,SP+MRP8/14组与SP组相比无升高（0.0055±0.003）vs（0.0063±0.006）,无统计学意义（P>0.05）;24h时SP组较PBS组升高明显（0.0124±0.012）vs（0.0006±0.0002）,（P<0.05）,SP+MRP8/14组与SP组相比升高明显（0.0348±0.018）vs（0.0124±0.012）,（P<0.05）;48h时SP组较PBS组升高明显（0.0239±0.010）vs（0.0005±0.0002）,（P<0.05）,SP+MRP8/14组与SP组相比升高显著（0.0434±0.020）vs（0.0239±0.010）,（P<0.05）。4)SP注射后6h,SP组MCP-1 mRNA较PBS组升高（0.1613±0.1942）vs（0.00695±0.00672）,但无统计学意义（P>0.05）,SP+MRP8/14组与SP组相比升高（0.5132±0.2306）vs（0.1613±0.1942）,（P<0.05）;24h时SP组较PBS组明显升高（0.2927±0.1291）vs（0.00614±0.0584）,（P<0.05）,SP+MRP8/14组与SP组相比明显升高（2.818±1.262）vs（0.2927±0.1291）,（P<0.05）;48h时SP组较PBS组明显升高（0.387±0.0841）vs（0.00067±0.00044）,（P<0.05）,SP+MRP8/14组与SP组相比显著升高（4.721±1.589）vs（0.387±0.0841）,（P<0.05）。6、ELISA方法检测TNF-α、CRP、IL-6、MCP-1蛋白的浓度:6.1、ELISA方法检测血清中TNF-α、CRP、IL-6、MCP-1蛋白的浓度:侧脑室注射6h后,SP组血清TNF-α的浓度较PBS组升高（54.341±5.068）vs（37.379±3.841）pg.ml^-1,（P<0.05）;SP+MRP8/14组与SP组相比升高（84.204±7.159）vs（54.341±5.068）pg.ml^-1,（P<0.05）;24h时SP组较PBS组升高明显（85.889±1.342）vs（37.183±3.736）pg.ml^-1,（P<0.05）,SP+MRP8/14组与SP组相比升高明显（273.074±31.713）vs（85.889±1.342）pg.ml^-1,（P<0.05）;48h时SP组较PBS组升高明显（149.724±10.391）vs（41.859±8.575）pg.ml^-1,（P<0.05）,SP+MRP8/14组与SP组相比显著升高（335.842±20.623）vs（149.724±10.391）pg.ml^-1,（P<0.05）。侧脑室注射6h后,SP组血清CRP的浓度较PBS组升高（16.943±1.932）vs（11.322±1.224）ng.L^-1,（P>0.05）;SP+MRP8/14组与SP组相比升高（18.712±0.833）vs（16.943±1.932）ng.L^-1,（P>0.05）;24h时SP组明显高于PBS组（21.638±2.168）vs（11.880±0.641）ng.L^-1,（P<0.05）,SP+MRP8/14组与SP组相比升高（28.093±1.782）vs（21.638±2.168）ng.L^-1,（P<0.05）;48h时SP组较PBS组升高（26.783±0.591）vs（12.839±2.073）ng.L^-1,（P<0.05）,SP+MRP8/14组与SP组相比显著升高（30.626±1.774）vs（26.783±0.591）ng.L^-1,（P<0.05）。侧脑室注射6h后,SP组血清IL-6的浓度较PBS组升高（229.024±24.002）vs（62.628±11.571）pg.ml^-1,（P<0.05）;SP+MRP8/14组高于SP组（577.111±53.557）vs（229.024±24.002）pg.ml^-1,（P<0.05）;24h时SP组较PBS组明显升高（1223.345±103.112）vs（64.044±3.892）pg.ml^-1,（P<0.05）,SP+MRP8/14组与SP组相比升高明显（2326.765±144.669）vs（1223.345±103.112）pg.ml^-1,（P<0.05）;48h时SP组较PBS组升高明显（2153.850±182.272）vs（49.309±15.26）pg.ml^-1,（P<0.05）,SP+MRP8/14组显著高于SP组（2895.417±34.544）vs（2153.850±182.272）pg.ml^-1,（P<0.05）。侧脑室注射后6h,SP组MCP-1的浓度较PBS组升高（126.990±20.115）vs（67.995±17.733）pg.ml^-1,（P<0.05）;SP+MRP8/14组与SP组相比升高（226.832±36.838）vs（126.990±20.115）pg.ml^-1,（P<0.05）;24h时SP组较PBS组明显升高（239.921±8.530）vs（52.406±19.259）pg.ml^-1,（P<0.05）,SP+MRP8/14组明显高于SP组（1306.669±102.119）vs（239.921±8.530）pg.ml^-1,（P<0.05）;48h时SP组较PBS组升高明显（489.987±27.689）vs（58.294±13.203）pg.ml^-1,（P<0.05）,SP+MRP8/14组与SP组相比升高显著（1513.495±22.769）vs（489.987±27.689）pg.ml^-1,（P<0.05）。6.2、ELISA方法检测脑组织匀浆中TNF-α、CRP、IL-6、MCP-1蛋白的浓度:侧脑室注射6h后,SP组脑组织匀浆TNF-α的浓度较PBS组升高（364.884±32.385）vs（300.415±21.272）pg?mg^-1,（P<0.05）;SP+MRP8/14组TNF-α与SP组相比升高（453.451±37.941）vs（364.884±32.385）pg?mg^-1,（P<0.05）;24h时SP组较PBS组明显升高（376.230±77.487）vs（287.875±91.347）pg?mg^-1,（P<0.05）,SP+MRP8/14组明显高于SP组（650.764±145.614）vs（376.230±77.487）pg?mg^-1,（P<0.05）;48h时SP组较PBS组明显升高（536.972±47.004）vs（252.222±62.096）pg?mg^-1,（P<0.05）,SP+MRP8/14组显著高于SP组（1058.782±181.951）vs（536.972±47.004）pg?mg^-1,（P<0.05）。侧脑室注射6h后,SP组脑组织匀浆CRP的浓度较PBS组升高（1.673±0.6411）vs（1.335±0.5090）ng.mg^-1,（P>0.05）;SP+MRP8/14组与SP组相比升高（2.363±1.8868）vs（1.673±0.6411）ng.mg^-1,（P>0.05）;24h时SP组较PBS组升高（2.908±0.4788）vs（1.455±0.4393）ng.mg^-1,（P<0.05）,SP+MRP8/14组高于SP组（4.854±1.1500）vs（2.908±0.4788）ng.mg^-1,（P<0.05）;48h时SP组CRP较PBS组升高明显（7.740±1.248）vs（1.396±0.681）ng.mg^-1,（P<0.05）,SP+MRP8/14组显著高于SP组（14.293±2.046）vs（7.740±1.248）ng.mg^-1,（P<0.05）。侧脑室注射6h后,SP组脑组织匀浆IL-6的浓度较PBS组升高（512.102±13.617）vs（397.429±9.998）pg?mg^-1,（P<0.05）;SP+MRP8/14组与SP组相比升高（885.784±134.836）vs（512.102±13.617）pg?mg^-1,（P<0.05）;24h时SP组较PBS组升高（1715.402±142.809）vs（374.470±26.298）pg?mg^-1,（P<0.05）,SP+MRP8/14组高于SP组（1907.884±106.241）vs（1715.402±142.809）pg?mg^-1,（P<0.05）;48h时SP组较PBS组升高（2142.090±98.117）vs（378.498±34.886）pg?mg^-1,（P<0.05）,SP+MRP8/14组显著高于SP组（2808.924±171.509）vs（2142.090±98.117）pg?mg^-1,（P<0.05）。侧脑室注射后6h,SP组脑组织匀浆MCP-1的浓度较PBS组高（383.366±25.761）vs（240.694±47.047）pg?mg^-1,（P<0.05）;SP+MRP8/14组高于SP组（579.320±43.008）vs（383.366±25.761）pg?mg^-1,（P<0.05）;24h时SP组较PBS组升高（846.938±137.067）vs（288.277±41.896）pg?mg^-1,（P<0.05）,SP+MRP8/14组高于SP组（1208.930±11.011）vs（846.938±137.067）pg?mg^-1,（P<0.05）;48h时SP组较PBS组升高（1131.959±80.333）vs（256.048±23.459）pg?mg^-1,（P<0.05）,SP+MRP8/14组显著高于SP组（2156.143±66.382）vs（1131.959±80.333）pg?mg^-1,（P<0.05）。7、免疫组化:四组小鼠均可见NF-κB p65棕黄色颗粒,6h、24h、48h PBS组及MRP8/14组NF-κB p65仅少量表达;SP组6h时表达开始上调（23.54±1.252）vs（0.88±0.835）、24h（38.65±1.959）vs（1.00±0.756）、48h（47.88±1.808）vs（0.88±0.835）,各时间点与PBS组比较明显增高（P<0.05）;SP+MRP8/14组较SP组进一步增高6h（29.38±2.326）vs（23.54±1.252）、24h（45.88±1.959）vs（38.65±1.959）、48h（67.25±2.765）vs（47.88±1.808）,有统计学意义（P<0.05）。结论:1、本实验通过侧脑室途径注射SP混悬液,成功建立了小鼠SP脑膜炎模型。2、促炎症因子TNF-α、CRP、IL-6、MCP-1在SP脑膜炎小鼠的脑组织和血清中表达量均显著升高,这些促炎症因子参与了SP脑膜炎的免疫炎症反应过程。3、在SP脑膜炎小鼠模型中,MRP8/14使脑组织和血清的促炎症因子TNF-α、CRP、IL-6、MCP-1的表达量均进一步升高,提示MRP8/14对SP脑膜炎机体的促炎症效应。4、进一步的胞内信号通路研究发现,MRP8/14干预使SP脑膜炎小鼠脑内NF-κB p65蛋白表达显著上调,提示在SP脑膜炎的免疫病理机制中,MRP8/14可能通过NF-κB信号途径正调控了SP脑膜炎的免疫炎症反应,参与了SP脑膜炎的病情进展。