连翘为木犀科连翘属植物连翘Forsythia suspense(Thunb.)Vahl的干燥果实,广泛分布于中国、韩国、日本以及许多欧洲国家。连翘对于许多疾病都有较好的治疗效果,如肾炎,丹毒,淋病,溃疡等,正因如此,它被视为一种重要的中药材而广泛应用。现代研究表明,连翘中富含多种活性化学成分,主要有木脂素类、黄酮类等。其中,连翘脂素是一种重要的木脂素类成分,在抗氧化、降低血脂、抑制低密度脂蛋白的氧化等方面显示出一定的药理活性。建立体外肝微粒体孵育体系,采用液质联用技术,对连翘脂素在肝微粒体中的代谢产物进行鉴定,同时研究体外大鼠肝微粒连翘脂素代谢的酶动力学及选择性CYP450酶抑制剂对其代谢的影响。通过测定大鼠肝微粒体中探针药物咪达唑仑代谢物(1-羟基咪达唑仑)的含量,计算连翘脂素的IC50值,从而评价其对CYP3A酶的抑制作用。第一部分连翘脂素在大鼠肝微粒体中的代谢研究目的:建立体外大鼠肝微粒体孵育体系,应用LC-MS/MS法,对连翘脂素在大鼠肝微粒体中的代谢产物进行鉴定。方法:超速离心法制备大鼠肝微粒体,采用LC-MS/MS法测定孵育液中的代谢物。将温孵样品分别在EMS-IDA-EPI、MRM-IDA-EPI模式下进行检测,分析反应生成的连翘脂素代谢产物。采用Diamonsil C18色谱柱(250×4.6 mm,5μm),流动相为0.1%甲酸水-乙腈,梯度洗脱,流速为800μL·min-1;进样量20μL。采用负离子模式进行检测,电喷雾离子源,源温度为650℃。结果:通过与空白样品比较,检测到13个Ⅰ相代谢物,未能检测到葡萄糖醛酸代谢产物。同时,对负离子模式下连翘脂素可能的裂解途径进行了推断。结论:所建立的LC-MS/MS测定法应用于连翘脂素在大鼠肝微粒体中的代谢,为连翘脂素的药物代谢动力学研究提供了依据。第二部分连翘脂素在人肝微粒体中的代谢研究目的:建立体外人源肝微粒体孵育体系,应用UHPLC-Q-TOF-MS法,对连翘脂素在人肝微粒体中的代谢产物进行鉴定。方法:采用Phenomenex Kinetex C18色谱柱(100×2.1mm,2.6μm),以0.1%甲酸水-乙腈为流动相进行梯度洗脱,流速为400μL·min-1;进样量5μL。采用正离子模式进行检测,电喷雾离子源,源温度为550℃,质量数扫描范围m/z 100~1000。结果:对ESI-MS正离子模式下连翘脂素可能的裂解途径进行推测,同时鉴定连翘脂素在肝微粒体中的8个代谢产物。结论:所建立的连翘脂素在人肝微粒体中的UHPLC-Q-TOF-MS测定法简便快速。未能检测到葡萄糖醛酸代谢产物。第三部分连翘脂素在大鼠肝微粒体中的酶促反应动力学及酶表型鉴定目的:研究连翘脂素体外大鼠肝微粒体代谢的酶动力学,计算其酶促反应动力学参数,并考察选择性CYP450酶抑制剂对连翘脂素代谢的影响。方法:分别以温孵时间、肝微粒体蛋白浓度和底物浓度为考察对象,优化温孵条件,用Lineweaver-Burk作图法计算连翘脂素在大鼠肝微粒体中的酶动力学参数。运用CYP450酶选择性抑制剂研究参与连翘脂素肝微粒体代谢的主要CYP亚型。结果:连翘脂素在大鼠肝微粒体中最佳温孵时间为20 min,蛋白浓度为1 mg·m L-1,底物浓度为30μmol·L-1,Km=44.85μmol·L-1,Vmax=0.4286μmol·(min·mg protein)-1。化学抑制剂试验表明,奎宁、4-甲基吡唑、盐酸噻氯匹定能够明显抑制连翘脂素的代谢。结论:CYP2B、CYP2D和CYP2E1是参与连翘脂素代谢的主要代谢酶,CYP1A2、CYP2C和CYP3A没有明显参与催化其代谢。第四部分连翘脂素对大鼠肝微粒体CYP3A的抑制作用目的:采用探针底物法研究连翘脂素对大鼠肝微粒体CYP3A的抑制作用。方法:将CYP3A酶的特异性探针底物咪达唑仑与不同浓度的连翘脂素在大鼠肝微粒体中共温孵,采用LC-MS/MS法测定探针底物生成的代谢产物1-羟基咪达唑仑,计算其IC50值。同时将CYP3A酶的特异性抑制剂酮康唑与探针底物共温孵,且对方法进行考察与验证。结果:在大鼠肝微粒体温孵体系中,连翘脂素对CYP3A的IC50值为92.68 mol·L-1。酮康唑与探针底物共温孵所得的IC50值与文献报道的基本一致。结论:本研究建立的探针底物法可以用于预测连翘脂素对大鼠肝微粒体中CYP3A酶活性的抑制作用。连翘脂素的IC50表明其对CYP3A没有抑制作用。