背景骨髓间充质干细胞是由骨髓中分离而来的,由于其具有多种分化潜能,因此受到多个领域的广泛关注。骨髓间充质干细胞能在一定条件下诱导分化成多种成熟细胞,其中包括成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞,诱导骨髓间充质干细胞朝向成骨细胞分化的研究一直是本领域研究的热点。在组织损伤修复以及种植骨结合方面BMSCs也发挥重要功能：迁移到缺损组织部位,分化为成骨干细胞。SATB2全称为特异性AT富集序列结合蛋白2,是特异性AT富集序列结合蛋白家族中的一员,其主要与核基质蛋白结合。SATB2能够与唾液蛋白(BSP)和骨钙蛋白(OCN)的基因相互结合,并发挥调控其转录的作用。同时SATB2还能够增加Runt相关的转录因子2(Runx2)和活化转录因子4(ATF4)的转录活性,由此,SATB2在调节成骨分化中的重要作用渐渐被人们所认识。最近,SATB2被认为是一个成骨分化的新的标志物。SATB2不仅能够激活成骨相关转录蛋白的活性,并且能够增强其他转录因子的功能,因此,我们的研究目标是,深入探究SATB2在成骨分化中的作用。microRNA是小RNA家族的一种,能够结合信使RNA的非编码区域,通过降解或者抑制mRNA从而调节mRNA的活性,起到调节蛋白表达的作用。microRNA参与调节细胞多项生理功能,包括细胞的增殖、分化、调亡以及自噬等各种生理过程。最近的研究显示,多种microRNA能够参与骨髓间充质干细胞的分化过程,其中包括mir-31,34c,204,338-3p等等。mir-205之前被作为一个肿瘤抑制因子被广泛研究,前期的研究显示mir-205能够抑制肿瘤细胞的细胞增殖以及细胞迁移,然而最近的研究显示,mir-205在调节骨髓间充质干细胞的分化中也发挥着十分重要的作用。然而,相应的具体机制仍不完全清楚,并且mir-205在骨髓间充质干细胞中的作用也未得到证实,因此我们拟通过体外细胞实验,检测mir-205在骨髓间充质干细胞中的重要作用。目的通过体外原代培养骨髓间充质干细胞,检测mir-205在细胞增殖和细胞分化过程中改变。通过mir-205的抑制剂和模拟物抑制mir-205在骨髓间充质干细胞中的表达,观察改变mir-205之后,骨髓间充质干细胞分化过程中的改变。同时观察Runx2和SATB2的表达改变,揭示mir-205与SATB2和Runx2的关系,为阐明microRNA调节骨髓间充质干细胞功能提供有力的证据和新的思路。方法1.mir-205在大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化中的作用。采用骨髓间充质干细胞原代培养的方法观察mir-205在其成骨分化中的作用。运用RT-PCR实验检测mir-205在成骨分化中的表达。通过加入mir-205抑制剂和模拟物来改变骨髓间充质干细胞中mir-205的表达,通过检测成骨关键蛋白BSP和OPN的表达来检测骨髓间充质干细胞的成骨分化功能。2.mir-205对SATB2和Runx2的调节作用。我们首先通过生物信息学分析,发现mir-205与SATB2的3’UTR区存在碱基互补配对,提示两者可能存在密切的关系。通过Western blot实验检测发现,高表达mir-205能降低SATB2的蛋白表达。通过RT-PCR实验检测发现Runx2也是mir-205的靶mRNA。3. SATB2调节mir-205介导骨髓间充质干细胞的成骨分化。我们首先构建PEGFP-N1质粒,使SATB2在骨髓间充质干细胞中表达升高。通过Western blot实验检测Runx2蛋白的改变。另外我们通过ALP和OCN检测升高SATB2是否能有效增加骨髓间充质干细胞的成骨分化能力。4. MAPK信号通路在mir-205调节骨髓间充质干细胞中的作用。通过Western blot检测MAPK信号通路磷酸化程度的改变,干预mir-205后观察MAPK信号通路的改变。结果1.mir-205在骨髓间充质干细胞成骨分化中逐渐下降,而在细胞增殖过程中,无明显变化。RT-PCR实验结果显示,mir-205在骨髓间充质干细胞分化过程中呈时间依赖性下降,而在细胞增殖过程中却不发生变化。为了更加明确mir-205在骨髓间充质干细胞分化中的改变情况,我们采用Real time-PCR验证之前的结果,结果显示加入分化培养基后能有效降低mir-205的表达,统计学分析显示,差异有统计学意义(P<0.05)。而加入增殖分化培养基mir-205却不会发生降低,并且随着培养时间的延长,mir-205的表达下降。2.抑制mir-205的表达能增加骨髓间充质干细胞的成骨分化。我们通过加入mir-205抑制剂和模拟物来改变骨髓间充质干细胞中mir-205的表达,通过BSP和OPN的蛋白表达改变来反映骨髓间充质干细胞的分化情况。结果显示,当加入分化培养基48h后,我们发现加入mir-205模拟物能有效抑制BSP和OCN的蛋白表达水平。而加入mir-205的抑制剂能显著增加BSP和OCN的蛋白表达。同时,ALP活性实验和OCN分泌量实验结果显示,降低mir-205的表达能增加ALP的活性,同时增加OCN向周围的分泌量,而高表达mir-205能降低ALP活性和减少OCN分泌量。3.mir-205能够调节骨髓间充质干细胞中SATB2和Runx2的表达我们首先通过生物信息学的预测,发现mir-205与SATB2的3’UTR区存在碱基互补配对,提示两者可能存在密切的关系。为了进一步验证mir-205和SATB2之间的结合,我们通过点突变制造了突变型SATB2的3’UTR区。荧光素酶结果显示给予骨髓间充质干细胞mir-205模拟物能显著降低野生型SATB2的表达,而不能降低突变型SATB2。另外,通过Western blot实验检测发现,高表达mir-205能降低SATB2的蛋白表达。另外我们发现Runx2也是mir-205的靶mRNA,升高mir-205能够降低Runx2的表达,而降低mir-205能够升高Runx2的表达。我们的实验结果提示,mir-205可能是通过调节SATB2和Runx2影响骨髓间充质干细胞的成骨分化。4. SATB2能够调节mir-205介导骨髓间充质干细胞的成骨分化我们采用PEGFP-N1质粒升高SATB2的表达进一步证明SATB2在骨髓间充质干细胞分化的作用。通过Western blot实验我们发现,转染PEGFP-N1-SATB2质粒后,我们发现Runx2的蛋白表达明显升高。ALP和OCN检测结果发现,升高SATB2能有效增加骨髓间充质干细胞的成骨分化能力。以上实验结果提示,SATB2能调节mir-205介导的骨髓间充质干细胞的成骨分化。5.抑制mir-205能够增加ERK和MAPK的磷酸化水平ERK和MAPK通路在调节骨髓间充质干细胞的成骨分化中起到非常重要的作用,之前的研究显示MAPK在调节microRNA中也起到重要作用。因此我们接下来的实验检测ERK和MAPK信号通路在mir-205介导的成骨分化中的作用。结果显示在分化过程中,ERK和MAPK在分化过程中磷酸化程度逐渐加强,而加入mir-205能显著抑制ERK和MAPK的磷酸化。我们的结果显示mir-205可能是通过抑制ERK和MAPK的磷酸化来抑制骨髓间充质干细胞的成骨分化。结论在我们的实验中,我们通过体外原代培养骨髓间充质干细胞检测mir-205在细胞增殖和细胞分化过程中改变,之后通过mir-205的抑制剂和模拟物改变mir-205的表达,观察改变mi-205之后,细胞分化过程中的改变。通过检测Runx2和SATB2的表达改变,观察mir-205与SATB2和Runx2的关系。另外。我们通过检测分化过程中ERK和P38MAPK通路的相关变化,发现mir-205可能通过调节MAPK通路影响骨髓间充质干细胞的分化。我们的研究为理解microRNA调节骨髓间充质干细胞功能提供了有力的证据和新的思路。