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对虾养殖是我国重要的海产品养殖业之一,但近年来随着对虾养殖业的迅猛发展,养殖过程中爆发的细菌性疾病和病毒性疾病给对虾产业造成了巨大损失。为此,学者们认为积极研究对虾免疫机制,了解宿主与病原菌之间的相互作用关系,对寻找以防为主的生态学防治途径,实现对虾健康养殖等具有重要意义。有趣的是,包括本课题组在内的研究表明对虾血蓝蛋白是一种具有多种免疫活性的多功能蛋白,且研究显示其识别病原菌的作用靶位可能为外膜蛋白,但为何种外膜蛋白尚不清楚。为此,本研究在此基础之上,采取蛋白质组学、分子生物学策略对其进一步研究,所获研究结果如下: 首先,采用亲和孵育的方法收集与对虾血蓝蛋白(用兔抗血蓝蛋白73kDa亚基抗体亲和纯化所得血蓝蛋白,命名为LH73)相结合的外膜蛋白(Outermembraneproteins,Omps),SDS-PAGE研究显示,其包含分子量为35-45kDa的4种蛋白,分别命名为p1、p2、p3和p4,经MALDI-TOF-TOF质谱分析,发现p2和p3与副溶血弧菌为OmpU和like-OmpC具有高度同源性,提示其可能为血蓝蛋白与副溶血弧菌的相互作用蛋白。 在上述研究基础之上,并结合课题组的前期报道,继而采用基因克隆方法扩增OmpU、like-OmpC和OmpW三种外膜蛋白,序列比对分析发现OmpW和like-OmpC为2条新序列,提交数据库所获登录号为JX555977和JX555978。OmpW和like-OmpC全长分别为645、1050bp,编码214、349个氨基酸。经BLAST比对,与其它弧菌对应外膜蛋白序列分别有77-99％和60-99%的一致性,均具有典型的外膜蛋白结构域,在进化关系上与弧菌外膜蛋白同源。 最后,对这三种蛋白进行原核表达,并用Far-western-blotting分析纯化的重组蛋白与LH73的相互作用。结果显示,重组OmpU和like-OmpC确实能与LH73相互作用,与亲和蛋白质组学鉴定结果一致,但OmpW不能与LH73相结合。说明,副溶血弧菌外膜蛋白OmpU和like-OmpC确实可能是LH73的相互作用蛋白。 综上所述,本研究分别在蛋白质组学水平和分子生物学水平证实对虾血蓝蛋白与副溶血弧菌的相互作用蛋白可能为两种外膜蛋白:OmpU和like-OmpC,同时获得2个新的外膜蛋白序列(OmpW和like-OmpC)。所获研究结果为阐明血蓝蛋白与病原菌的识别模式,揭示血蓝蛋白的分子作用机制奠定了良好的基础,对促进对虾养殖业可持续发展具有重要意义。