溶菌酶是动植物界中广泛存在的一种天然活性物质,因其独特的抗菌和调理功能而被应用于动物生产、食品防腐以及医药制剂等诸多领域。其中,溶菌酶作为一种新型绿色的饲料添加剂在畜禽动物上的研究已久,但在水产动物上的应用研究仍较为薄弱,仅见于异育银鲫(Carassius auratus gibelio)和草鱼(Ctenopharyngodon idellus)。在现有的研究结果中我们发现溶菌酶的作用效果并不完全一致,可能在于鱼的种属和消化道内环境不同,使溶菌酶进入鱼体内后的活性发挥和吸收利用存在差异性,最终导致其利用效果的不同。为此,我们选用吉富罗非鱼(GIFT,Oreochromis niloticus)为本次研究对象,开展溶菌酶作用效果和吸收利用机制的研究,为提高饲用溶菌酶的利用率及其在水产饲料中的合理应用提供参考。内容主要包括六章:第一章通过研究在饲料中添加溶菌酶后对吉富罗非鱼生长、免疫–抗氧化能力和血清抗菌性能的影响,综合评估在正常养殖条件下溶菌酶在吉富罗非鱼饲料中的最适添加量;第二章设计氨氮应激试验,从血清生化、抗菌性能和肝脏抗氧化能力方面评估不同溶菌酶添加水平对吉富罗非鱼抗氨氮应激能力的影响,为溶菌酶在应激条件下的使用提供参考剂量;第三章从消化生理方面探究不同溶菌酶添加水平对吉富罗非鱼消化道组织结构及营养物质消化吸收的影响,深入解析溶菌酶与罗非鱼生长之间的内在关系;第四章探究外源性溶菌酶的添加对吉富罗非鱼内源c型溶菌酶和NF–κB基因表达的影响,以期从分子水平寻找外源溶菌酶与内源免疫基因和其调控通路中关键基因之间的相互联系,解析溶菌酶的添加对吉富罗非鱼免疫机能的影响;第五章根据前期研究结果设计四个溶菌酶添加水平下的胃排空试验,根据胃排空时间和消化道(包括内容物)内环境的变化探究添加不同水平的溶菌酶对罗非鱼消化生理上的影响规律;第六章采用体内外试验结合法,通过测定饲用溶菌酶对罗非鱼肝脏和胃肠道各部位的耐受性以及运用FITC–lysozyme体内示踪技术来探索溶菌酶在鱼体内主要部位的吸收代谢规律,从而得出其在吉富罗非鱼体内的适宜作用部位和功效发挥时间。试验一:饲料中添加溶菌酶对吉富罗非鱼生长、免疫–抗氧化功能及血清抗菌性能的影响为探究正常养殖条件下溶菌酶在吉富罗非鱼(11.35±0.08)g饲料中的最适添加量,设置6个溶菌酶添加水平的试验饲料,分别在基础组饲料中添加0(l0)、18(l18)、36(l36)、54(l54)、72(l72)和90(l90)mg/kg的溶菌酶制品(5×103u/mg),在室外水泥池中的等大尼龙网箱中饲喂吉富罗非鱼60d,考察不同溶菌酶添加水平对吉富罗非鱼生长、免疫–抗氧化能力和血清抗菌性能的影响。结果表明:(1)54mg/kg溶菌酶添加组鱼的生长性能和饲料利用情况最优,增重率和蛋白质效率均显著高于对照组,饲料系数显著低于对照组(p<0.05);肝体比随溶菌酶添加水平的增加呈现下降趋势,90mg/kg添加组显著低于对照组(p<0.05);脾脏指数在36和54mg/kg添加组显著低于对照组(p<0.05);全鱼粗蛋白和粗灰分含量在54mg/kg添加组均呈现较高水平,显著高于对照组(p<0.05)。(2)溶菌酶添加水平对罗非鱼的免疫–抗氧化能力产生影响,54和72mg/kg添加水平能显著提高鱼体血清和肝脏的超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活性,降低丙二醛含量(p<0.05);肝脏溶菌酶活性在54和72mg/kg添加组均显著高于对照组(p<0.05),而血清溶菌酶活性随溶菌酶添加水平的增加呈现下降趋势(l90组除外),显著低于对照组(p<0.05)。(3)血清抗菌试验显示,54和72mg/kg溶菌酶添加组罗非鱼对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、嗜水气单胞菌和溶藻弧菌的抑制能力显著高于对照组(p<0.05),而对枯草芽孢杆菌的抵抗能力最低,比对照组分别低34.71%和42.21%(p<0.05)。综上所述,在吉富罗非鱼饲料中添加54mg/kg溶菌酶制品可改善其生长性能;当添加水平为54和72mg/kg时,罗非鱼的免疫-抗氧化能力和血清抗菌性能均得到了显著提高。本试验条件下,适宜添加量为54和72mg/kg。试验二:饲料溶菌酶添加水平对氨氮应激下吉富罗非鱼血清生化指标、抗菌性能和肝脏抗氧化能力的影响为探究溶菌酶对吉富罗非鱼抗氨氮应激能力的影响并确定非正常情况下的适宜添加量,本试验以养殖试验结束后的吉富罗非鱼(83.74±3.02)g为研究对象,以氯化铵为应激源,并调整水体总氨氮(t–an)的表观浓度为50mg/l,进行24h急性氨氮胁迫,通过比较各组鱼的血清生化指标、抗菌活性和肝脏抗氧化指标来综合判断其抗氨氮应激能力并由此确定溶菌酶在特定条件的适宜添加量。结果表明:(1)应激后,各组鱼的血清生化指标在组间存在较大差异(p<0.05),不同溶菌酶添加水平下的鱼体对氨氮应激产生了不同的响应机制。l54组鱼主要通过激发免疫系统并调节蛋白质代谢来抵抗氨氮浓度突变;l72和l90组鱼主要通过调节高密度脂蛋白和低密度脂蛋白、胆固醇和甘油三酯之间的动态变化来缓解氨氮对机体的应激。(2)血清抗菌试验表明,l54和l72组鱼对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和嗜水气单胞菌的抑制能力最大,且显著高于对照组(p<0.05);l36~l90组对溶藻弧菌的抑制作用显著高于对照组和l18组(p<0.05);各溶菌酶添加组的鱼对枯草芽孢杆菌具有不同程度的保护作用。(3)应激后肝脏的超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶活性随溶菌酶添加水平的增加总体呈现先升后降的变化趋势,l54组显著高于对照组(p<0.05);各添加组丙二醛含量均显著低于对照组(p<0.05)。综上所述,54和72mg/kg溶菌酶添加水平对氨氮应激下吉富罗非鱼的血清生化指标、抗菌活性和肝脏抗氧化指标产生了最积极有效的调控,能够增强鱼体的抗应激能力,此添加水平为氨氮应激条件下的适宜添加量。试验三:饲料溶菌酶添加水平对吉富罗非鱼消化道组织结构及营养物质消化吸收的影响在实验一吉富罗非鱼的饲养过程中,每15d收集粪便用于检测各组鱼对营养物质的表观消化吸收率,饲养60d后取消化道各组织检测消化酶活性并做石蜡切片。结果显示:(1)饲料中添加溶菌酶对吉富罗非鱼肝脏和胃肠道消化酶活性产生了不同程度的影响(p<0.05)。l36~l72组的胃、前肠和中肠蛋白酶活性显著高于对照组(p<0.05),而肝脏和后肠蛋白酶活性无组间差异(p>0.05);l72或l90组的肝脏、胃和后肠淀粉酶活性显著对照组(p<0.05),前肠淀粉酶活性在l54组显著高于对照组(p<0.05),中肠淀粉酶活性在除l72组外的其余添加组均显著高于对照组(p<0.05);l54或l72组的脂肪酶活性显著高于对照组(p<0.05)。(2)肠道切片统计结果表明,l54和l72组的前肠和中肠绒毛密度、高度和宽度均显著高于对照组(p<0.05),肌层厚度与对照组无显著性差异(p>0.05);l36~l72组的后肠绒毛密度和高度显著高于对照组(p<0.05),绒毛宽度在溶菌酶添加组有升高趋势,除l90组外均无显著差异(p>0.05),而肌层厚度在除l54组外的其余溶菌酶添加组有下降趋势(p<0.05);杯状细胞数量在l54和l72组均显著高于对照组(p<0.05)。(3)肝脏切片图显示,l36和l54组鱼肝细胞排列整齐,形状饱满,相较于对照组更加致密,但高剂量添加组的肝脏健康程度有下降趋势。(4)消化吸收率方面,在养殖i(1~15d)和ii(16~30d)期内,l36~l90组对粗蛋白的消化吸收率显著高于对照组(p<0.05),但对粗脂肪的消化吸收率无组间差异性(p>0.05);在养殖iii(31~45d)和iv(46~60d)期,l36~l90组在整体水平上对干物质、粗蛋白和粗脂肪的消化吸收率均显著高于对照组(p<0.05)。由此得出,本试验条件下,在吉富罗非鱼饲料中添加36~72mg/kg溶菌酶能提高消化酶活性并促进肝肠发育和健康;添加36~90mg/kg溶菌酶能不同程度地提高鱼体对饲料干物质、粗蛋白和粗脂肪消化吸收率。。在实验一吉富罗非鱼饲养60d后取各组鱼头肾、脾脏、肝脏和肠道组织并运用rt–pcr技术探索吉富罗非鱼不同组织内源c型溶菌酶和nf–κb信号通路相关基因表达水平对外源性添加溶菌酶的响应。结果发现:头肾中,l54和l90组鱼c1、c2、c3型溶菌酶和nf–κb(p65)基因mrna表达量下调(p<0.05);脾脏中,3种c型溶菌酶和nf–κb(p65)mrna表达量均随溶菌酶添加水平的提高而呈现先升后降的变化趋势,l54和l90组3种c型溶菌酶分别显著高于或低于对照组(p<0.05),nf–κb(p65)mrna表达量在l18组显著高于对照组和其余各组(p<0.05);肝脏中,l18组的c1型溶菌酶和l54组的c2、c3型溶菌酶mrna表达量均显著上调(p<0.05),而nf–κb(p65)基因的相对表达量在除l18组外均显著低于对照组(p<0.05);肠道中,l18和l54组的c2、c3型溶菌酶表达量均低于或显著低于对照组(p<0.05),nf–κb(p65)mrna相对表达量随溶菌酶添加水平的提高呈现先升后降的变化趋势,l18组显著高于对照组(p<0.05),l54和l90组显著低于对照组(p<0.05)。由此得出,添加18和54mg/kg的外源溶菌酶饲喂吉富罗非鱼60d可分别提高肝脏和脾脏中nf–κb(p65)和三种内源c型溶菌酶的表达水平,而nf–κb(p65)和溶菌酶基因在mrna表达水平上没有直接相关性。试验五:不同溶菌酶添加水平下吉富罗非鱼的胃排空及消化道内容物特性研究为考察吉富罗非鱼摄食不同溶菌酶添加水平饲料的胃排空时间和在摄食消化过程中内容物特性的变化规律,本试验首先用溶菌酶添加水平分别为0(l0)、18(l18/低)、54(l54/中)和90(l90/高)mg/kg的饲料饲喂吉富罗非鱼60d,然后采用fe2o3标记和连续取样法对初始体重为(160±11.23)g的各组试验鱼进行胃排空试验,通过分析胃内容物总铁含量的变化确定其胃排空时间,同时对比研究了各组鱼摄食消化过程中内容物水分、ph、营养成分含量以及内容物和组织消化酶活性的变化规律。结果表明:(1)指数模型和平方根模型均能较好地描述各组鱼的胃排空曲线,但通过r2比较,l0和l18组更适合指数模型,l54和l90组更适合平方根模型。据各自的最优模型分别计算l0、l18、l54和l90组鱼胃50%排空时间依次为:7.97h、6.68h、6.74h、5.49h。(2)在24h的摄食消化过程中,溶菌酶添加组鱼消化道各段内容物的水分含量总体高于对照组(p<0.05),同时有一个较快的上升速率(摄食后0~12h)和较长时间的峰期;l54和l90组鱼胃内容物ph值在摄食初期(0~6h)下降速率较快,食物到达肠道后仍能保持较低的ph值(p<0.05),随摄食时间的延长和食物的推移,l54组鱼内容物ph值能较快地恢复或接近初始水平;消化酶活性方面:l54和l90组鱼胃组织和内容物中消化酶比活力均显著高于对照(p<0.05),l54组前肠蛋白酶和脂肪酶活性在摄食0.5~6h均显著高于对照组(p<0.05),而组织淀粉酶活性无显著性差异(p>0.05);摄食0~12h内,l54和l90试验四:外源性添加溶菌酶对吉富罗非鱼不同组织内源性c型溶菌酶及nf–κb信号通路基因表达的影响组鱼中肠内容物的蛋白酶和淀粉酶比活力在整体水平上高于对照组(P<0.05),各组内容物脂肪酶比活力在整个摄食过程中均无显著性差异(P>0.05);L54组鱼后肠内容物蛋白酶活性在数值上高于其他组(P>0.05),而淀粉酶和脂肪酶基本没有太大差异。(3)营养成分方面:L54和L90组鱼内容物粗蛋白和粗灰分含量显著高于对照组(P<0.05),而粗脂肪含量显著低于对照组(P<0.05)。由此可见,饲料中添加54和90 mg/kg溶菌酶能够缩短吉富罗非鱼的胃排空时间,并通过加速水分吞饮、酸化食物以及提高消化酶活性和分泌量来提高机体对营养物质的消化利用。试验六:饲用溶菌酶在吉富罗非鱼消化道的耐受性和吸收代谢规律体内外研究为探究饲用溶菌酶在吉富罗非鱼消化道和体内的适宜作用和吸收部位并确定其药效发挥时间,本试验采用体外模拟实验测定饲用溶菌酶对吉富罗非鱼肝脏和胃肠道各部位的耐受性,运用FITC–lysozyme体内示踪技术探索溶菌酶在鱼体内主要部位的吸收代谢规律。结果表明:(1)吉富罗非鱼肝脏和胃肠道粗酶液对溶菌酶制品活性有明显的抑制作用,随反应时间延长,其相对保留率逐渐降低。溶菌酶在吉富罗非鱼消化道各部位的相对保留率从高到低依次为后肠>中肠>胃>肝脏>前肠。说明其在吉富罗非鱼后肠的耐受性最佳,在前肠最差。另外,该溶菌酶制品在L54组鱼肝脏和胃中的相对保留率最高,并分别显著高于L18、L72、L90组和L0、L18、L36组(P<0.05)。(2)FITC–lysozyme示踪结果表明,吉富罗非鱼单次口服溶菌酶48h内,其在鱼体各部位的相对吸收率从高到低依次为中肠>前肠>后肠=胃=肝脏=中肾=血清>肌肉,因此溶菌酶主要在吉富罗非鱼肠道上半部被吸收(P<0.05);此外,从溶菌酶在血清中的药—时曲线图上可以看出,此溶菌酶制品的血药浓度可以维持12h,之后慢慢消除。综上认为,后肠是溶菌酶的最适存活部位,而前肠和中肠是其主要吸收部位,其药效发挥时间为12h。