论文部分内容阅读
目的:邻苯二甲酸-单-乙基己酯(Mono-(2-ethylhexyl)phthalate,MEHP)是邻苯二甲酸二乙基己酯(Di-2-ethylhexyl phthalate,DEHP)的活性代谢产物。DEHP是邻苯二甲酸酯类化合物(Phthalate esters,PAEs)中应用最为普遍的一种人工合成的有机化合物,可以显著提高塑料制品的可塑性和柔韧性,被广泛地应用到医疗用品当中。DEHP进入人体后很快经肝脏和肾脏代谢成MEHP。早期的研究大部分关注MEHP对肝脏、肾脏、生殖系统和生长发育毒性,MEHP还具有心血管系统毒性,但是其分子机制尚未完全阐明。本实验以EA.hy926细胞为研究对象,探讨MEHP作用于EA.hy926细胞后能否通过活性氧自由基(Reactive oxygen species,ROS)诱导自噬。方法:研究MEHP作用于EA.hy926细胞后是否通过ROS诱导自噬的发生,应用MTT法(四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法)检测不同浓度(0μM-1600μM)MEHP处理后的EA.hy926细胞存活率的变化;使用不同试剂自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)、自噬激活剂雷帕霉素、活性氧抑制剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)、si RNA Akt1、Akt1激活剂胰岛素预处理后,用不同浓度(0μM-400μM)MEHP处理EA.hy926细胞,检测细胞存活率的变化;用透射电子显微镜观察细胞自噬小体的超微结构;用Western blot法(蛋白质免疫印迹法)检测不同浓度(0μM-200μM)MEHP处理及NAC预处理后P62和LC3(细胞内自噬标记物-微管相关蛋白轻链3)蛋白表达水平的变化;用DCFH-DA(2’,7’-二氢二氯荧光素)检测不同浓度(0μM-200μM)MEHP处理及NAC预处理后细胞内ROS的含量变化;用荧光显微镜观察经JC-1染色后EA.hy926细胞内线粒体膜电位的改变情况;用免疫荧光方法检测不同浓度(0μM-200μM)MEHP处理后细胞内p-Akt1水平的变化;使用不同试剂(NAC、si RNA Akt1、胰岛素)预处理后,检测细胞内p-Akt1水平的变化;用Western blot法检测si RNA Akt1、胰岛素预处理后的LC3蛋白表达水平的变化。结果:经过不同浓度MEHP(0μM-400μM)染毒24 h后,随着MEHP浓度的增加EA.hy926细胞存活率显著下降;用3-MA、NAC和胰岛素干预后,细胞存活率明显增高;用雷帕霉素、si RNA Akt1干预后,细胞存活率明显下降。在透射电子显微镜下可观察到自噬小体,且数量增加;LC3-II和P62蛋白表达随MEHP浓度增加而增加,这说明聚集的自噬小体是由于自噬小体降解障碍引起的,用NAC预处理后,LC3-II蛋白表达量减少;细胞内ROS水平随MEHP剂量的升高而升高,用NAC预处理后可有效降低ROS水平;线粒体膜电位随MEHP浓度的升高而下降,用NAC预处理后可显著升高使线粒体膜电位;MEHP处理后细胞内p-Akt1水平下降,用NAC、胰岛素预处理后p-akt1水平升高,用si RNA Akt1干预后,p-Akt1水平显著下降;用胰岛素预处理后,LC3-II蛋白表达水平降低,而si RNA Akt1干预后则增高。结论:MEHP作用于EA.hy926细胞后,可促使细胞内自噬小体的形成,MEHP主要依赖于ROS通过Akt1通路诱导自噬性细胞死亡。