黄瓜CsWOX1基因调控花瓣发育研究及其互作蛋白筛选

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前期研究中发现黄瓜CsWOX1基因提前终止会导致花瓣发育出现异常,具体表现为花瓣全裂且变窄。为了进一步挖掘与CsWOX1共同调控花瓣发育的蛋白,本研究利用酵母双杂技术从黄瓜顶芽c DNA文库中进行筛选,并对候选蛋白中的AP2/ERF家族成员Csa6G491020(CsAP2)进行了研究,主要研究结果如下:1、与对照株系相比,CsWOX1基因提前终止的突变体花瓣显著变窄,表明CsWOX1蛋白的短截影响了黄瓜花器官的发育。使用CRISPR-Cas9技术进行基因编辑,共得到4个拟南芥wox1 wox3双突变体株系,随后在wox1 wox3双突变体株系中过表达CsWOX1基因。通过观察拟南芥阳性植株的花瓣发育情况,发现在wox1 wox3双突变体中过表达CsWOX1基因能够在一定程度上弥补花瓣变窄的表型缺陷,证实了CsWOX1在花瓣横向扩增的功能较为保守。2、构建pGBKT7-CsWOX1诱饵载体,并验证了诱饵载体对酵母的生长没有抑制或毒害且对报告基因没有自激活效应。在黄瓜顶芽c DNA文库中筛选到17个与CsWOX1转录因子互作的候选蛋白。对筛选到的蛋白分析后选取其中可能影响花发育的Csa6G491020(CsAP2)进一步研究,并通过回转试验验证其互作可靠性,并通过Bi FC技术确定了CsWOX1蛋白与CsAP2互作发生在细胞核。3、基因的表达分析显示CsAP2基因在黄瓜各组织均有表达,蛋白的亚细胞定位表明CsAP2蛋白分布在细胞核。生物信息学比对发现CsAP2与At AP2较为相似,在拟南芥中过表达CsAP2影响了花器官的发育,此外还引起拟南芥体内花器官干细胞调控途径中的At AG、At WUS、At ARF3基因表达出现不同程度的下调,而与花序转化相关的At LFY表达上调。
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