背景原发性肝癌是一种高度恶性肿瘤,肝细胞肝癌是其主要的类型,是全世界最常见恶性肿瘤之一。根据最新统计,全球每年新发肝癌病例达到60万,居所有恶性肿瘤的第五位,死亡率位居恶性肿瘤第三位。其临床特点是发现迟、进展迅速、预后差。目前中国肝癌的病例超过全世界半数以上,严重危害中国人的生命健康,成为中国医师棘手的病种。原发性肝癌的起病、进展是多种因素导致的长期、复杂的连续过程。其病因主要包括酒精、肝炎病毒感染等,这些病因最终通过复杂的多种基因突变导致肿瘤的发生。因此,力争发现在肝癌中有意义的基因是明确复杂致病的前提。突触结合蛋白(synaptptagmin,Syt)一类分泌囊泡的蛋白,山N端跨膜结构域和C端结合Ca2+的C2结构域(包括C2A和C2B)构成。Ca2+结合的突触结合蛋白亚型调节了神经元、神经内分泌细胞以及各种其他分泌细胞融合孔的扩大。突触结合蛋白7(Syt7)是Syt家族中的一员,其在肿瘤中的作用报道较少。已有研究发现,Syt家族在几种类型的肿瘤中表达异常,如Syt(未提是哪类Syt)在小细胞肺癌中表达升高,Sytl3在左侧结肠癌标本中的表达低于右侧结肠癌,Sytl在神经母细胞瘤细胞中高表达,而钙调素对甲状旁腺激素的抑制效应有助于甲状旁腺瘤中Sytl的表达缺失。延伸的Sytl(E-Sytl)的磷酸化参与了原癌基因肺癌融合激酶激活的侵袭通路。但关于Syt尤其是Syt7在肝癌中未见文献报道。目的(1)检测原发性肝癌患者肿瘤及癌旁组织中Syt7蛋白的表达情况,分析肿瘤组织中Syt7表达水平与患者临床病理资料的关系(2)检测不同的肝癌细胞系中Syt7 mRNA的表达情况方法(1)收集蚌埠医学院第一附属医院2013年9月至2018年2月期间行手术切除的原发性肝癌患者的石蜡标本,免疫组化检测肿瘤及癌旁组织中Syt7蛋白的表达情况(2)qRT-PCR检测不同的肝癌细胞系中Syt7 mRNA表达情况(3)分析肝癌组织Syt7蛋白的表达与患者临床、病理资料的关系(4)肿瘤及癌旁组织中Syt7蛋白阳性率的比较及Syt7蛋白阳性率与临床病理学参数的相关性分析均采用x 2检验的方法,通过Kaplan-Meier模型的log-rank检验及Cox回归模型分析影响总体生存率(overall survival,OS)及无瘤生存率(disease-free survival,DFS)的因素,认定P<0.05时具有显著性差异。结果(1)Syt7蛋白在肝癌患者肿瘤组织中的阳性表达率为64.00%(48/75),在癌旁组织中阳性表达率为2.67%(2/75),在肿瘤组织中的阳性表达率明显高于癌旁组织,差异具有统计学意义(P<0.05);(2)与Syt7阴性组相比,Syt7阳性组患者血清中AFP水平较高、肿瘤直径较大、肿瘤数目较多、血管侵犯的风险增加、TNM分期较晚、肿瘤分化程度较低,结果均具有显著性差异(P均<0.05);(3)Cox单因素分析表明,术前肿瘤大小、血管侵犯、TNM分期、肿瘤分化程度、Child-Pugh分级及Syt7表达水平是影响肝癌患者术后OS的主要预后因素。多因素分析表明,术前肿瘤直径>5cm(HR=4.22,95%CI:1.44-12.39,P=0.009)、血管侵犯(HR=2.71,95%CI:1.15-6.40,P=0.023)、Child-Pugh B 级(HR=4.16,95%CI:1.54-11.25,P=0.005)及 Syt7 阳性(HR=2.84,95%CI:1.08-7.49,P=0.035)是术后OS的独立危险因素;(4)Cox单因素分析表明,术前AFP水平、肿瘤大小、血管侵犯、TNM分期、肿瘤分化程度、Child-Pugh分级及Syt7表达水平是影响肝癌患者术后DFS的主要预后因素。多因素分析表明,术前AFP≥200ng/ml(HR=2.37,95%CI:1.13-4.97,P=0.022)、肿瘤直径>5cm(HR=4.30,95%CI:1.43-12.95,P=0.010)、肿瘤具有血管侵犯(HR=2.57,95%CI:1.10-6.01,P=0.030)、Child-Pugh B 级(HR=4.65,95%CI:1.72-12.56,P=0.002)及 Syt7 阳性(HR=3.43,95%CI:1.26-9.29,P=0.016)是术后DFS的独立危险因素;(5)qRT-PCR结果显示,在肝癌细胞系Huh-7、Hep-3B中Syt7 mRNA表达水平较高,而在肝癌细胞系SMMC-7721、Hep G2、BEL-7402中表达水平较低。结论(1)原发性肝癌患者肿瘤标本中Syt7蛋白阳性率明显高于癌旁标本,Syt7表达水平与患者血清AFP水平、瘤体直径、肿瘤病灶数目、血管侵犯、TNM分期及肿瘤分化程度密切相关。(2)Syt7表达水平是影响肝癌患者术后OS及DFS的独立预后因素。(3)在肝癌细胞系Huh-7、Hep-3B中Syt7 mRNA表达水平较高,而在肝癌细胞系SMMC-7721、Hep G2、BEL-7402中表达水平较低背景原发性肝癌是肝胆系统最常见的恶性肿瘤之一,其病因多样,在西方国家以饮酒和丙肝病毒感染为主,而在中国以乙肝病毒感染多见。由于其起病隐匿,早期症状不明显,早期发现较为困难,进而导致根治性手术切除率低。因而,其综合治疗显得尤为重要,包括化疗,基因靶向治疗等。肝癌的生物学行为较差,预后欠佳,目前的治疗手段仍有限。研究表明,肝癌的起病、进展一定是多种基因参与的多步骤的复杂过程。近年来随着不断进步的分子生物学技术,使针对肝癌的基因治疗成为可能的研究方向。因而,研究在肝癌的增殖、克隆形成、侵袭及转移中起至关重要作用的基因,通过有目的裁剪、替换致病基因甚至修复表达异常的基因,可以进一步丰富肝癌的综合治疗手段。一些基因可能在肝癌细胞中表达异常,但是否对肝癌细胞增殖、克隆、周期变化、凋亡等细胞学及侵袭、转移等行为学方面有影响,以及如何影响,是研究的关键。神经系统释放神经递质和胰岛β细胞释放胰岛素所涉及的胞吐作用是生物体参与生命活动以及产生生化反应的重要组成部分。在这些生理生化过程中多种蛋白发挥了重要的作用。胞内各隔室间的蛋白转运受来自一个细胞器转运蛋白的介导并选择性地与另一个细胞器融合。囊泡的细胞器特异性转运需要调节囊泡转运、着位和融合的蛋白。根据 SNARE(soluble N-ethylmaleimide-sensitive fusion protein attachment protein receptor)假说:每一类囊泡包含一个 v-SNARE(vesicle SNARE),并只能与一个t-SNARE(target SNARE)关联到合适的受体细胞膜。其中,Syt、突触小泡蛋白(synaptophysin)和 VAMP(vesicle-associated membrane protein)属于v-SNARE;而突触融合蛋白(syntaxin)和SNAP-25家族属于t-SNARE。SNARE蛋白参与了分泌通路中的每一步,但每个SNARE蛋白具有隔室特异性,并有助于着位和融合的特异性。在Syt家族中,Syt7作为Ca2+高亲和的感应器而发挥作用,参与了非神经细胞包括胰腺β细胞的胰岛素分泌颗粒、PC12细胞中大而致密中心的囊泡、溶酶体和大囊泡的胞吐作用中对融合孔动力学的调节。除了上述生理功能外,Syt7也参与了一些病理生理过程,如克氏锥虫侵袭细胞、帕金森病、肺纤维化等。此外有研究报道Syt7是Ca2+调节溶酶体囊泡分泌所必须的,可以通过调节囊泡分泌促进中性粒细胞的迁移。由此,我们提出疑问,Syt7是否可以影响肿瘤细胞的功能其内在机制又是如何呢?查阅文献尚未见Syt7影响肿瘤细胞功能尤其是肝癌细胞的报道。目的体外实验研究干扰Syt7对肝癌细胞系SMMC-7721,BEL-7404增殖的影响,体内实验验证干扰Syt7对肝癌裸鼠移植瘤生长的抑制作用方法(1)以Syt7基因为模板,设计其RNA干扰序列,以构建Syt7基因的RNA干扰慢病毒载体;将含有Syt7基因RNA干扰序列的慢病毒进行肝癌细胞系SMMC-7721、BEL-7404感染实验,分为实验组(shSyt7组)和对照组(shCtrl组);(2)qRT-PCR检测靶点干扰后肝癌细胞系SMMC-7721及BEL-7404中Syt7 mRNA水平,评价干扰效率;Western Blot检测靶点干扰Syt7后外源蛋白水平表达;(3)Celigo细胞计数检测细胞生长;(4)克隆实验检测慢病毒干扰后细胞成瘤能力;(5)PI-FACS检测细胞周期的变化;(6)MTT实验检测肝癌细胞增殖能力;(7)裸鼠成瘤实验检测干扰Syt7对移植瘤生长的影响;(8)采用SPSS 21.0统计学软件进行统计学分析,均值±标准差的形式表示所有计量资料,成组资料间的比较采用t检验。P<0.05表示差异具有显著性意义。结果(1)成功构建了 Syt7干扰慢病毒载体,建立了稳定干扰Syt7的细胞系;荧光观察显示感染细胞效率达到70%以上;(2)慢病毒感染后,SMMC-7721及BEL-7404中Syt7 mRNA的表达量受到明显抑制(P<0.05),敲减效率分别为62.3%及52.3%。Western Blot显示慢病毒感染对Syt7基因的外源蛋白表达水平有显著的敲减作用;(3)通过Celigo分析仪连续检测5天,结果发现,实验组SMMC-7721及BEL-7404细胞的生长受到明显抑制,表明Syt7可明显促进肝癌细胞的生长;(4)克隆实验结果发现,实验组SMMC-7721及BEL-7404细胞的集落数目显著减少,提示Syt7明显地提高了肝癌细胞的克隆形成能力;(5)PI-FACS检测细胞周期的结果提示,实验组SMMC-7721细胞G1期的细胞数量明显减少,而处于G2/M期的细胞则无明显变化,此外,处于S期的细胞数量明显增多。实验组BEL-7404细胞处于G1期的细胞明显增多,处于S期的细胞无显著变化,处于G2/M期的细胞明显减少,结果提示干扰Syt7后可使细胞周期停滞。提示Syt7可明显影响肝癌细胞的周期分布;(6)通过MTT实验连续检测5天,结果发现,实验组SMMC-7721和BEL-7404细胞的增殖受到明显的抑制,提示Syt7明显提高了肝癌细胞的增殖能力;(7)干扰Syt7后裸鼠体内移植瘤的荧光强度显著降低,瘤体体积及重量均显著降低。结论(1)干扰目的基因Syt7可抑制肝癌细胞系SMMC-7721和BEL-7404的增殖。(2)干扰Syt7可以诱导肝癌细胞系SMMC-7721和BEL-7404的周期停滞。(3)干扰Syt7可以抑制肝癌细胞系SMMC-7721和BEL-7404的克隆形成。(4)干扰Syt7可以抑制裸鼠体内移植瘤的生长。背景肝癌的综合治疗手段多样,而根治性手术切除仍是其中的首选治疗手段。由于肝癌的不良生物学行为如多中心性、进展快、容易复发和转移的特点,导致总体治疗效果仍较差,生存率不高。外源性的环境污染、内源性的染色体改变、细胞内基因的变化等综合因素最终导致细胞的恶性转化及肿瘤的发生。因此,发现肝癌细胞和组织标本中异常表达,且进一步实验证明在肝癌中有功能的基因仍然是不够的。进一步探讨基因相关的信号转导通路,明确其在通路中角色,有助于明确肝癌的发病、进展机制,使在此基础上寻找到肝癌靶向治疗的靶点成为可能。关于肝癌中信号通路的研究较多,如Wnt/β-catenin信号通路、p38-MAPK通路、Hedgehog 信号通路、P13K-hkt、MAPK、SAPK/JNK、NF-κ B、上皮间质转化、细胞自噬相关通路、细胞凋亡相关死亡信号通路及线粒体通路等在肝癌中可能都起一定的研究。Syt7在肿瘤中的作用未见报道,前两部分研究表明Syt7在肝癌组织标本及肝癌细胞中高表达,且可以促进肝癌细胞增殖及肝癌进展,其在肝癌中所涉及的通路尚不清楚。此部分研究力争明确Syt7在肝癌中所参与的信号通路及其在通路中的角色,为探寻新的肝癌治疗靶点提供理论及实验基础。目的检测干扰目的基因Syt7后对肝癌细胞SMMC-7721信号通路中关键信号分子的影响方法(1)以Syt7基因为模板,设计其RNA干扰靶点,以构建Syt7基因的RNA干扰慢病毒载体;含有Syt7基因RNA干扰序列的慢病毒进行肝癌细胞SMMC-7721感染实验,分为实验组(shSyt7组)和对照组(shCtrl组)。(2)qRT-PCR检测干扰后SMMC-7721中Syt7 mRNA水平,评价干扰效率。(3)使用 Cell Signaling Technology(CST)公司的 PathScan(？)Stress and Apoptosis Signaling Antibody Array Kit,检测和比较实验组和对照组信号通路中关键分子的变化。(4)Western blot进一步验证Syt7干扰后肝癌细胞系SMMC-7721中相关基因外源性蛋白表达水平。(5)采用SPSS 21.0统计学软件进行数据分析,均值±标准差的形式表示所有计量资料,P<0.05表示差异具有显著性意义。结果(1)成功构建了 Syt7干扰慢病毒载体,建立了稳定干扰Syt7的细胞系;荧光观察,显示细胞感染效率达到70%以上;(2)实验组SMMC-7721细胞中Syt7 mRNA的表达量受到明显抑制(P<0.05),敲减效率达到53.4%;(3)PathScan(?)Antibody Array Kit结果提示,与对照组相比,实验组信号通路中p53、Chk1蛋白的磷酸化水平显著上调;(4)Western blot进一步提示,实验组p53、Chk1基因的外源性蛋白表达明显上调。结论干扰Syt7基因可以通过激活Chk1-p53信号通路抑制肝癌细胞SMMC-7721的增殖和使细胞周期停滞于S期。