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滋养层细胞(trophoblast, TR)是形成哺乳动物胎盘的主要细胞,在胚胎植入和妊娠维持中起重要的作用。多种分子和复杂的信号网络调控TR的发育和分化,其中涉及的分子机理对揭示胚胎发育机制意义重大。目前体外分离培养TR细胞是多数动物胎盘发育和分化研究的主要手段,但滋养层干细胞(trophoblast stem cell, TSC)因其具有可分化为所用类型TR细胞的特点使其成为胎盘研究的理想模型。目前只在小鼠等少数几个物种上获得了TSC,猪的TSC至今未有报道。仅少数研究使用体内胚分离了猪的TR细胞,对TR细胞的培养和特征没有深入的描述,体外胚胎培养的猪TR细胞系未见报道。滋养层细胞的功能和分化研究表明,ROCK (Rho-associated coiled-coilprotein kinases)做为Rho的下游效应蛋白,参与调控滋养层细胞迁移、增殖和凋亡等多种活动,对滋养层的发育有重要影响。本研究比较了猪体外受精(in vitro fertilization, IVF)和孤雌激活(parthenogenetic activation, PA)囊胚的差异,分别将这两种囊胚接种于KOSR/bFGF培养液和STO饲养层细胞的培养体系中进行TR的分离培养。随后对获得的pIVFTR和pPATR细胞进行了鉴定,包括碱性磷酸酶检测,TSC、TR和细胞多能性相关标志分子在mRNA或蛋白水平的表达检测,染色体数目分析和细胞分化能力的检测等,以确定所获得的细胞是否具有滋养层细胞特征,同时比较了不同来源的pIVFTR和pPATR细胞的差异。此外,本研究还分析了ROCK抑制剂Y-27632对猪TR细胞生长、形态和基因表达的影响。主要研究结果如下：1、猪孤雌激活与体外受精胚胎制备及囊胚质量比较本研究选用猪IVF和PA囊胚进行滋养层细胞分离培养,首先对两种不同发育类型囊胚的差异进行了比较研究。实验结果表明,猪IVF和PA胚胎发育时间同步,在第2天发育为4细胞,第3天发育为6-8细胞,第6天形成扩张囊胚,胚胎卵裂率及囊胚率并无显著差异。但IVF囊胚的平均直径显著大于PA囊胚(p<0.01),并且IVF囊胚的总细胞数(Total)和内细胞团(inner cell mass, ICM)细胞数显著多于PA囊胚(p<0.05); IVF囊胚的ICM/Total比例高于PA囊胚,PA囊胚的滋养外胚层细胞(trophectoderm, TE)/Total比例高于IVF囊胚。细胞多能性相关分子OCT4、SOX2和滋养层细胞特异分子CDX2三个蛋白在IVF和PA囊胚中都有表达且无明显差异。以上结果说明,IVF囊胚的直径和细胞数量大于PA囊胚,细胞数的差异主要体现在ICM上；在形态、发育率和关键多能因子的表达上,PA与IVF囊胚并无差别。因此,优质的PA来源的囊胚可作为IVF囊胚的平行实验材料,用于滋养层细胞培养及鉴定研究。2、猪孤雌激活与体外受精囊胚来源的滋养层细胞的培养和鉴定本研究利用KOSR/bFGF培养液+STO饲养层细胞的培养体系,对体外发育的囊胚酶消化法去透明带后进行整胚接种培养,结果表明猪PA和IVF囊胚均可生长得到TR细胞,所获得的pPATR和pIVFTR细胞系可在体外长期传代培养。两种囊胚来源的TR细胞呈上皮细胞样形态,细胞内含有丰富的脂滴。Real-timePCR结果表明,细胞表达TR细胞标志基因(TEAD4、CDX2、ELF5、HAND1、CDH3、GATA3、RTS2、MASH2、PAG、KRT18和GCM1)和端粒酶活性相关基因(TERC和TERF2),其中CDX2、ELF5、KRT18、HAND1、GCM1和PAG等基因的表达水平在两类细胞间存在差异；印迹基因IGF2,PEG1和PEG1O在pPATR细胞中的表达低于pIVFTR细胞。细胞化学和免疫荧光结果表明,两种囊胚来源的TR细胞均呈碱性磷酸酶阳性,滋养层标志因子KRT7、KRT18、CDX2和胚胎干细胞因子SSEA1阳性。pPATR为四倍体或非整倍体核型,pIVFTR细胞核型正常。另外,TR细胞在两种不含bFGF的培养液中培养说明pPATR和pIVFTR细胞都具有向成熟细胞分化的能力。3、ROCK抑制剂Y-27632对猪TR细胞的作用用ROCK抑制剂Y-27632培养猪TR细胞,可改善TR细胞单细胞培养的生长状态,因此发现了Y-27632对猪TR细胞生长的促进作用。生长曲线和细胞平均集落面积曲线测定了Y-27632显著促进TR细胞的生长速率,却抑制猪胎儿成纤维细胞的生长。利用Real-time PCR和Western blotting进一步检测发现了ROCK1和ROCK2在猪TR细胞中的表达被Y-27632抑制,同时滋养层相关的基因CDX2、ELF5、HAND1、GATA3、GCM1、TEAD4和PAG的表达水平上调,并且CDX2的蛋白水平发生了明显的上调。综合上述研究结果说明,猪PA和IVF囊胚都可被用来培养获取TR细胞,用KOSR/bFGF培养液和STO饲养层细胞培养体系培养的猪TR细胞具有典型的TR细胞特征和一些TSC特征,ROCK抑制剂Y-27632对猪TR细胞的生长和滋养层特征基因的表达有促进作用,这些结果为探索猪TSC或TR细胞更好的培养条件的建立提供参考,也为猪胎盘发育和分化的研究提供了一个可选的工具。