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研究背景有汗性外胚叶发育不良(hidrotic ectodermal dysplasia,HED),即 Clouston综合征,是一种以甲营养不良、毛发缺陷和掌跖角化过度等三联征为特征的遗传性综合征,属于常染色体显性遗传。编码缝隙连接蛋白30(Cx30)的GJB6基因为HED的致病基因。至今共发现五种错义突变,分别为G11R、A88V、V37E、D50N和N14S。目前对HED的发病机制研究甚少,即Cx30所发挥的功能,需要我们进行深入研究。随着人类基因组计划的逐步完成,基因表达谱芯片成为研究基因差异表达的重要工具之一,基因芯片技术具有高通量、低成本、自动化、防污染等优势。本课题组前期利用Tet-on基因表达系统成功构建了稳定表达GJB6基因野生型及其突变型A88V的HaCaT细胞株,为后续实验提供了稳定的实验模型。本课题继续运用该技术构建GJB6基因中功能最强的G11R突变的HaCaT细胞株,并制作Affymetrix表达谱芯片,旨在发现并探讨GJB6基因可能参与的信号通路及作用机制。目的采用基因芯片技术筛选稳定转染GJB6突变基因的HaCaT细胞差异表达基因,初步探讨突变基因在HaCaT细胞上可能调控的信号通路及机制。方法利用Tet-on基因表达系统构建稳定表达GJB6基因突变型G11R的HaCaT细胞株,制作Affymetrix表达谱芯片:提取细胞总RNA,质检合格后,进行荧光标记,芯片杂交,洗染,扫描,数据分析,筛选出差异表达基因。利用IPA(Ingenuity Pathway Analysis)系统对芯片数据进行生物信息分析,筛选出差异表达倍数较多且与疾病功能密切相关的基因,使用WES全自动蛋白质印迹定量分析系统进行表达验证。结果总RNA质检结果:根据Thermo Nano Drop 2000检测的A260/A280值以及Agilent2100 检测 RIN 和 28S/18S 值,结果显示 RIN>= 9.3,28S/18S>= 1.5,A260/A280在1.99到2.06之间,样品质检合格,进行后续实验。基因芯片结果数据筛查结果:OE组(目的基因组)与NC组(对照组)比较,上调基因数为546个,下调基因数目为926个(p<0.05且差异均在2倍以上)。生物信息分析显示:差异基因富集多方面疾病及功能,其中细胞凋亡、细胞分化、上皮细胞分化、真皮细胞分化、表皮细胞分化、上皮组织生长、上皮组织的瘤形成等可能与GJB6 基因的功能密切相关(p<0.05,z 值分别为 2.224,2.756,2.968,2.882,2.562,2.423,2.798)。重点选取上皮分化通路和细胞凋亡通路的10个差异基因进行验证。WES全自动蛋白质印迹定量分析结果:MKI67蛋白表达下调73.65%,PLK1蛋白表达下调48.41%,BCL2L11蛋白表达上调147.21%,与芯片筛选结果一致。结论基因芯片技术可以快速、高通量、高敏度地筛选出GJB6突变基因的差异表达基因,这些差异基因通过调节多个信号通路发挥作用,为HED发病机制的进一步研究奠定了基础。