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目的:
为深入探究妊娠期和哺乳期母鼠高脂饮食(High-fatdiet,HFD)是否能改变成年雄性后代的HPA轴活动,本研究(1)监测孕期及哺乳期母体HFD暴露的成年子代基础HPA轴活动包括皮质酮脉冲频率和脉冲幅度及皮质酮基础水平的变化.(2)观察母鼠HFD暴露的成年后代HPA轴对不同应激模型如束缚(1h)、脂多糖(25μg/kg,iv)和胰岛素导致的低血糖所诱导的不同的应答反应.③通过杏仁核特定脑区注射药物,造成杏仁核兴奋毒性损伤,来评估杏仁核亚核在母鼠HFD暴露所诱导的HPA变化中的作用,包括血清皮质酮(Cortisoterone)水平变化、脑组织促肾上腺皮质激素释放激素(Corticotropin-releasingfactor,CRF)水平变化、脑组织糖皮质激素受体(Glucocorticoidreceptor,GR)的mRNA表达和蛋白表达水平、脑组织盐皮质激素受体(Mineralocorticoidreceptor,MR)的mRNA表达和蛋白表达水平.
方法:
配种:孕期及哺乳期SD母鼠交配前10天开始喂食高脂饲料或标准饲料(Controldiet,CD),乳鼠断奶后,均喂标准饲料至15-16周龄,得到两组不同饮食类型的成年子代大鼠,即C/C组、H/C组.
实验方法:
分别给两组大鼠颈静脉装配心导管,用于在实验中不中断地采集血液样品,从8am开始,在24小时内每隔10分钟采集小血样(15μl)(第二天6am止),-20℃保存,来分析基础皮质酮分泌的模式.
两组大鼠进行应激造模.(1)心理应激:将大鼠放置到固定器(1h),在重复的束缚应激中,相同的实验方案以5天的间隔重复4次;(2)免疫应激:给两组大鼠注射脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS,25ug/kg,iv);(3)代谢应激:大鼠禁食过夜,但不控制饮水,采集对照血液后,通过第二静脉导管给予胰岛素(在0.3ml盐水中0.3IU/kg,iv).全程监测血糖以确定低血糖.
杏仁核特定脑区损害后10天颈静脉插管,通过应激模型造模.(1)放射免疫法(Radioimmuniassay)直接测定肝素化血浆中总皮质酮浓度;(2)取室旁核脑组织,通过原位杂交(Insituhybridization)测得室旁核的CRF的mRNA表达水平.(3)通过荧光定量聚合酶链式反应(Quantitativereversetranscriptase-polymerasechainreaction,qRT-PCR)检测杏仁核的GR、MR的mRNA表达水平.④通过免疫蛋白印迹(Westernblot,WB)测定杏仁核GR和MR蛋白水平.
结果:
1.基础皮质酮分泌
C/C组和H/C组同时间达到皮质酮分泌最低点.
H/C组动物较C/C组,需更长时间达到峰值皮质酮水平,且在昼夜循环的明暗阶段表现为升高.
2.不同应激反应的皮质酮水平变化
(1)心理束缚应激:束缚后,C/C组和H/C组动物的皮质酮较基础水平显著增加,存在统计学差异(P<0.05).
在束缚1h内,两组皮质酮水平改变无统计学差异(P>0.05).
束缚后3h内H/C组的皮质酮水平显著高于C/C组,存在统计学差异(P<0.05)且C/C组已恢复到基线水平.
(2)免疫应激:LPS注射后,C/C组和H/C组的皮质酮水平显著增加,并维持超4h的高水平.H/C组皮质酮水平远高于C/C组,存在统计学差异(P<0.05).
(3)代谢应激:C/C组和H/C组对胰岛素引起的低血糖的反应无统计学差异(P>0.05).两组皮质酮水平均高于基础水平,但在3h内恢复到基线水平.
3.重复束缚应激刺激的皮质酮水平变化
重复束缚应激暴露期间,两组皮质酮水平较基础水平显著增加,存在统计学差异,(P<0.05)但反应程度和速度各不相同.
C/C组较H/C组对皮质酮的抑制作用显著减弱,存在统计学差异(P<0.05).
4.PVN中的CRFmRNA表达
H/C组的基础CRFmRNA水平显著高于C/C组,存在统计学差异(P<0.05).
反复束缚应激时,H/C组较C/C组延缓出现CRFmRNA表达水平下降.
5.杏仁核MeA区和CeA区兴奋毒性损害
通过Nissl染色观察到,H/C组和C/C组的MeA区和CeA区损害组存在广泛的神经元丢失,胶质细胞浸润和注射器轨迹.而完整组无广泛的神经元丢失和胶质细胞浸润,有注射器轨迹.
束缚应激后,H/C组较C/C组的双侧MeA区损害动物血浆皮质酮水平增加更明显,但较同组MeA区完整的动物血浆皮质酮水平显著下降.
免疫应激时,双侧CeA损伤的C/C组和H/C组大鼠中皮质酮水平的升高较同组CeA区完整的动物血浆皮质酮水平显著下降.
6.杏仁核GR和MR的蛋白和mRNA表达
杏仁核中GR和MR的蛋白质和mRNA表达H/C组较C/C组在杏仁核中基础GRmRNA和蛋白质更高表达,存在统计学差异(P<0.05).
在C/C组和H/C组之间基础MRmRNA和蛋白质水平的无显著统计学差异(P>0.05).
结论:
1.怀孕和哺乳期间母体高脂饮食对成年后代HPA轴的活动有长期的影响.
2.母体饮食以应激源特异性方式影响HPA的反应,神经内分泌反应交替出现在心理和免疫应激,但不是代谢应激.
3.母体HFD暴露可通过不同神经通路选择性地调节HPA对不同输入信号的反应.
为深入探究妊娠期和哺乳期母鼠高脂饮食(High-fatdiet,HFD)是否能改变成年雄性后代的HPA轴活动,本研究(1)监测孕期及哺乳期母体HFD暴露的成年子代基础HPA轴活动包括皮质酮脉冲频率和脉冲幅度及皮质酮基础水平的变化.(2)观察母鼠HFD暴露的成年后代HPA轴对不同应激模型如束缚(1h)、脂多糖(25μg/kg,iv)和胰岛素导致的低血糖所诱导的不同的应答反应.③通过杏仁核特定脑区注射药物,造成杏仁核兴奋毒性损伤,来评估杏仁核亚核在母鼠HFD暴露所诱导的HPA变化中的作用,包括血清皮质酮(Cortisoterone)水平变化、脑组织促肾上腺皮质激素释放激素(Corticotropin-releasingfactor,CRF)水平变化、脑组织糖皮质激素受体(Glucocorticoidreceptor,GR)的mRNA表达和蛋白表达水平、脑组织盐皮质激素受体(Mineralocorticoidreceptor,MR)的mRNA表达和蛋白表达水平.
方法:
配种:孕期及哺乳期SD母鼠交配前10天开始喂食高脂饲料或标准饲料(Controldiet,CD),乳鼠断奶后,均喂标准饲料至15-16周龄,得到两组不同饮食类型的成年子代大鼠,即C/C组、H/C组.
实验方法:
分别给两组大鼠颈静脉装配心导管,用于在实验中不中断地采集血液样品,从8am开始,在24小时内每隔10分钟采集小血样(15μl)(第二天6am止),-20℃保存,来分析基础皮质酮分泌的模式.
两组大鼠进行应激造模.(1)心理应激:将大鼠放置到固定器(1h),在重复的束缚应激中,相同的实验方案以5天的间隔重复4次;(2)免疫应激:给两组大鼠注射脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS,25ug/kg,iv);(3)代谢应激:大鼠禁食过夜,但不控制饮水,采集对照血液后,通过第二静脉导管给予胰岛素(在0.3ml盐水中0.3IU/kg,iv).全程监测血糖以确定低血糖.
杏仁核特定脑区损害后10天颈静脉插管,通过应激模型造模.(1)放射免疫法(Radioimmuniassay)直接测定肝素化血浆中总皮质酮浓度;(2)取室旁核脑组织,通过原位杂交(Insituhybridization)测得室旁核的CRF的mRNA表达水平.(3)通过荧光定量聚合酶链式反应(Quantitativereversetranscriptase-polymerasechainreaction,qRT-PCR)检测杏仁核的GR、MR的mRNA表达水平.④通过免疫蛋白印迹(Westernblot,WB)测定杏仁核GR和MR蛋白水平.
结果:
1.基础皮质酮分泌
C/C组和H/C组同时间达到皮质酮分泌最低点.
H/C组动物较C/C组,需更长时间达到峰值皮质酮水平,且在昼夜循环的明暗阶段表现为升高.
2.不同应激反应的皮质酮水平变化
(1)心理束缚应激:束缚后,C/C组和H/C组动物的皮质酮较基础水平显著增加,存在统计学差异(P<0.05).
在束缚1h内,两组皮质酮水平改变无统计学差异(P>0.05).
束缚后3h内H/C组的皮质酮水平显著高于C/C组,存在统计学差异(P<0.05)且C/C组已恢复到基线水平.
(2)免疫应激:LPS注射后,C/C组和H/C组的皮质酮水平显著增加,并维持超4h的高水平.H/C组皮质酮水平远高于C/C组,存在统计学差异(P<0.05).
(3)代谢应激:C/C组和H/C组对胰岛素引起的低血糖的反应无统计学差异(P>0.05).两组皮质酮水平均高于基础水平,但在3h内恢复到基线水平.
3.重复束缚应激刺激的皮质酮水平变化
重复束缚应激暴露期间,两组皮质酮水平较基础水平显著增加,存在统计学差异,(P<0.05)但反应程度和速度各不相同.
C/C组较H/C组对皮质酮的抑制作用显著减弱,存在统计学差异(P<0.05).
4.PVN中的CRFmRNA表达
H/C组的基础CRFmRNA水平显著高于C/C组,存在统计学差异(P<0.05).
反复束缚应激时,H/C组较C/C组延缓出现CRFmRNA表达水平下降.
5.杏仁核MeA区和CeA区兴奋毒性损害
通过Nissl染色观察到,H/C组和C/C组的MeA区和CeA区损害组存在广泛的神经元丢失,胶质细胞浸润和注射器轨迹.而完整组无广泛的神经元丢失和胶质细胞浸润,有注射器轨迹.
束缚应激后,H/C组较C/C组的双侧MeA区损害动物血浆皮质酮水平增加更明显,但较同组MeA区完整的动物血浆皮质酮水平显著下降.
免疫应激时,双侧CeA损伤的C/C组和H/C组大鼠中皮质酮水平的升高较同组CeA区完整的动物血浆皮质酮水平显著下降.
6.杏仁核GR和MR的蛋白和mRNA表达
杏仁核中GR和MR的蛋白质和mRNA表达H/C组较C/C组在杏仁核中基础GRmRNA和蛋白质更高表达,存在统计学差异(P<0.05).
在C/C组和H/C组之间基础MRmRNA和蛋白质水平的无显著统计学差异(P>0.05).
结论:
1.怀孕和哺乳期间母体高脂饮食对成年后代HPA轴的活动有长期的影响.
2.母体饮食以应激源特异性方式影响HPA的反应,神经内分泌反应交替出现在心理和免疫应激,但不是代谢应激.
3.母体HFD暴露可通过不同神经通路选择性地调节HPA对不同输入信号的反应.