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铁是生物体十分重要不可缺少的元素,它参与体内电子传递、细胞呼吸、DNA合成以及作为辅助因子参与细胞内众多的酶促反应。铁在环境中主要以难溶的高铁离子(Fe3+)形式存在,它不能直接被机体吸收,所以缺铁是缺氮,缺磷之后的影响农业生产的第三大生理病害。高等植物缺铁会导致叶绿素合成减少,光合速率降低,严重影响植物的生长发育,造成巨大的经济损失。人体铁缺乏可导致缺铁性贫血,而过量又会引起组织损伤和铁质沉着病；所以细胞必须具备一套严格的调控机制调节铁的同化和代谢,维持细胞铁稳态。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)是存在于真核生物中的丝氨酸/苏氨酸型蛋白激酶,它与MAPKKK,MAPKK组成级联信号通路,接受外界刺激,其信号传递按照MAPKKK-MAPKK-MAPK依次磷酸化,在真核生物分化、生长、发育和凋亡等多方面发挥重要的作用。本研究基于从莱茵衣藻缺铁应答缺陷突变体库中筛选得到一个突变体mu9,而其缺失基因Femu9p是一个MAPKKK激酶,Femu9p基因的敲除和缺失是引起铁调控基因如FOX1、ATX1、FTR、和FEA1表达的显著降低,由此推断MAPK级联信号途径可能在衣藻缺铁信号传递中发挥作用。由此,我们对莱茵衣藻中MAPK、MAPKK、 MAPKKK家族相关激酶进行研究,通过RNAi干涉的技术对CrMAPK3,CrMEK1, CrMAPKKK13基因进行敲除,检测转基因藻株报告基因以及铁调控基因的表达,结果如下。(1)对莱茵衣藻的MAPK,MAPKK和MAPKKK基因家族进行生物信息学分析。所有莱茵衣藻的MAPK级联基因结构中都含有丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶结构域。莱茵衣藻MAPK家族含有TXYVXTRWRAPE(L/V)保守序列,莱茵衣藻MAPKK家族含有VGTXXYMSPE保守序列,莱茵衣藻MAPKKK家族保守区核心序列属于MEKK类和Raf类,即拥有G(T/S)PX(W/Y/F)MAPEV和GTXX(W/Y)MAPE保守序列。(2)RNA-seq分析莱茵衣藻MAPK级联途径基因差异表达,对培养24h-Fe,-N、-P,16℃低温处理的莱茵衣藻进行热图的绘制,结果表明：-Fe和16℃低温下,多数MAPK级联途径基因表达降低;而-P和-N条件下,多数MAPK级联途径基因表达升局。MAPK.MAPKK.MAPKKK基因家族在-Fe,-N,-P和16℃低温下转录表达的显著改变,说明它们可能参与-Fe,-N,-P和16℃低温信号应答和调控。(3)构建CrMAPK3,CrMEK1,CrMAPKKK13 RNAi表达载体并转化莱茵衣藻2A38,对转基因藻株进行细胞学和分子生物学检测。CrMAPK3 RNAi干涉载体转化莱茵衣藻2A38后,共得到转化子132个。-Fe培养进行藻株的ARS活性检测,结果显示共有88个转化子表现无色或浅蓝色,变色的比例为67.7%。转基因藻株RNAi11,RNAi37,RNAi62 CrMAPK3相对于对照mRNA分别显著下降,ARS酶活性分别降低82%,85%,83%,ARS mRNA水平降低了99%,内源CrFOX1,CrNRAMP2,CrATX1,CrFTR1,CrFEA1的mRNA水平显著下降。表明莱茵衣藻的CrMAPK3基因与莱茵衣藻细胞内的铁代谢相关基因表达调控有关。CrMEK1 RNAi干涉载体转化莱茵衣藻2A38后,共得到转化子81个。ARS活性检测结果显示有64个转化子表现无色,变色的比例为79.0%。转基因藻株RNAi1, RNAi2,RNAi18目标基因CrMEK1相对于对照mRNA分别显著下降,说明对目标基因CrMEK1沉默有效。转基因藻株RNAi1,RNAi2,RNAi18 ARS酶活性和mRNA水平显著下降,内源CrFOX1,CrNRAMP2,CrATX1,CrFTR1,CrFEA1的表达量均降低。表明莱茵衣藻CrMEK1基因与莱茵衣藻细胞内的铁代谢相关基因表达调控有关。CrMAPKKK13 RNAi干涉转基因藻株共得到84个。ARS活性检测结果显示有70个转化子表现无色,变色的比例为83.3%。转基因藻株RNAi4,RNAi16,RNAi51目标基因CrMAPKKK13相对于对照mRNA分别显著下降,ARS酶活性和mRNA水平显著下降,内源CrFOX1,CrNRAMP2,CrATX1,CrFTR1,CrFEA1的表达量均降低。表明莱茵衣藻CrMAPKKK13基因与莱茵衣藻细胞内的铁代谢相关基因表达调控有关。(4)莱茵衣藻CrMAPK3和CrMEK1定位于细胞质。