论文部分内容阅读
干扰素α2b(Interferonα2b,IFNα2b)是一种用于病毒性疾病和肿瘤性疾病治疗的多功能细胞因子,因其在体内的半衰期短从而限制其在临床上的应用。本研究室已成功构建人血清白蛋白(Human serum albumin,HSA)融合蛋白长效药物开发平台,将HSA与IFNα2b的N端(HSA-IFNα2b)融合并在毕赤酵母中成功表达。HSA-IFNα2b具有较好活性,但在毕赤酵母中表达融合蛋白时,存在融合蛋白不稳定、容易降解、产物不均一等问题。目前,中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary,CHO)表达系统表达的蛋白免疫原性低、人体相容性好、活性高。本课题将已经在毕赤酵母中表达HSA-IFNα2b的重组蛋白在高级表达系统CHO中进行表达制备,优化CHO发酵培养基并放大培养。本研究将IFNα2b连接到HSA的C端,构建融合蛋白HSA-IFNα2b。构建真核表达质粒pMH3/HSA-IFNa2b,电转转入CHO细胞中。经G418的抗性压力筛选和目的蛋白的表达量筛选,最终获得一株高表达的稳定细胞株(CHO/pMH3/HSA-IFNa2b)。表达的目的蛋白经Western Blot验证显示,产物具有IFNα2b和HSA的双抗原性。经悬浮驯化稳定后,通过批次筛选得到一株稳定的高克隆表达株,产量约为31 mg/L。重组细胞株的稳定性试验结果显示,不同代数之间蛋白的表达量和生长情况没有明显的差异。最终,获得一株能悬浮培养、稳定表达的单克隆细胞株。为筛选获得最优的悬浮培养基,本研究选择十七种商业化无血清培养基,快速筛选得到生长和表达良好的基础培养基(BM)和流加培养基(F4)。进一步优化培养基,通过在培养基中添加功能性添加因子丁酸钠、亚油酸、乙醇胺、苏拉明。结果显示,在培养基中添加丁酸钠作为培养基的添加因子,获得高表达的个性化无血清培养基。重组细胞株在BM中培养,当细胞密度超过8×106 cells/m L,继续补加F4可以支持细胞批次培养超过10×106 cells/mL,同时在500 m L摇瓶中培养时间至10 d,融合蛋白表达量达到61.5 mg/L。通过添加的2 mM丁酸钠,融合蛋白表达增长至81 mg/L。进一步考察添加丁酸钠的过程中细胞的生长代谢情况,结果显示:丁酸钠添加后24 h细胞处于G1期比例由41%升高到62.9%,同时提高融合蛋白HSA-IFNα2b mRNA的表达高达2.6倍,并对细胞生长代谢无明显影响。最后,在3 L摇瓶中进行了流加培养,并在5 L的AP-20一次性生物反应器上进行通气与搅拌方面工艺的初步摸索,在反应器上得到与摇瓶中相对一致的培养效果,融合蛋白表达量达到137 mg/L,实现了从摇瓶到反应器的工艺放大。离心获得发酵上清液后,依次通过蓝色亲和染料层析、疏水层析对表达产物进行分离纯化,获得的融合蛋白HSA-IFNα2b纯度96.8%,目的蛋白的总回收率为22.3%。对纯化后融合蛋白的活性进行检测,比活性为4.16×106 IU/mg,与毕赤酵母表达融合蛋白HSA-IFNα2b的生物活性水平基本相当。