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研究背景世界范围内,肺癌发病率位于所有恶性肿瘤第二位、死亡率位于第一位;在中国,其发病率和死亡率均位于第一位。肺腺癌是肺癌最为常见的病理类型,约占所有肺癌病例的40%左右。近年来肺腺癌的诊断和治疗已经有很大进步,很大程度上改善了患者预后,但尽管如此、肺腺癌五年生存率仍低于20%。因此,深入研究肺腺癌发病机制及挖掘新的生物标记物和潜在治疗靶点对改善患者预后显得尤为重要。miRNA通过完全或不完全的碱基互补配对原则结合于靶基因m RNA的3′-非翻译区域（UTRs）,参与靶基因转录后水平调控、导致其表达量降低。miRNA通过调控蛋白编码基因表达而参与肿瘤、炎症、糖尿病、高血压病等在内的多种病理过程。在肿瘤中,miRNA即能够调控肿瘤细胞的增殖和凋亡,又能够参与调控肿瘤细胞的迁移和侵袭能力,还能够参与肿瘤细胞耐药现象发生和免疫逃逸过程。此外miRNAs、尤其是循环样本中的miRNAs,因近年来作为疾病筛查、早期诊断、疗效评价、预测临床预后的临床生物学标记物而成为临床肿瘤学的研究热点。本研究通过miRNA高通量测序技术和生物信息学方法筛选miR-539-5p为研究对象,并结合生物信息学分析和系列功能实验探讨miR-539-5p影响肺腺癌细胞恶性生物学行为的调控机制。研究方法（1）构建肺腺癌Co-DEmiRNA-DEm RNA调控网络高通量测序技术完成临床队列（GSE151963）受试者血浆miRNA测序,下载公共平台癌基因组图谱（TCGA）肺腺癌数据集（TCGA＿LUAD）miRNAs和m RNAs测序数据;交集获得两个数据集（GSE151963和TCGA＿LUAD）表达一致的共同差异miRNAs（Co-DEmiRNAs）。miRDB、Target Scan和miRWalk在线数据库预测得到Co-DEmiRNAs靶基因m RNAs,TCGA＿LUAD肺腺癌组织差异m RNAs验证所预测靶基因m RNAs;Cytoscape软件构建Co-DEmiRNA-DEm RNA调控网络,确定核心miRNAs及靶基因。Cluster Profiler程序包完成核心miRNAs靶基因的基因功能注释和通路富集分析。（2）miR-539-5p在肺腺癌血浆、组织、细胞中的表达Co-DEmiRNA-m RNA调控网络确定miR-539-5p为目标miRNA;GSE151963和TCGA＿LUAD数据确定miR-539-5p在肺腺癌血浆、组织中的表达水平,实时荧光定量PCR检测miR-539-5p在正常支气管上皮细胞（BEAS-2B）和3株肺腺癌细胞系（A549、NCI-H1975、SPC-A1）表达量。（3）miR-539-5p对肺腺癌细胞恶性生物学行为的影响通过miR-539-5p模拟物（mimic）、抑制物（inhibitor）及各自的阴性对照物（Negative Control,NC）分别转染人肺腺癌A549细胞,构建过表达miR-539-5p和表达抑制的肺腺癌细胞模型,荧光实时定量PCR检测转染后细胞miR-539-5p表达量验证转染效率。通过CCK-8、平板克隆实验、划痕实验、Transwell小室法、流式细胞学技术检测细胞周期和凋亡、Western-Blot检测凋亡相关蛋白（Bcl-2和Bax）表达评价miR-539-5p表达量对肺腺癌细胞恶性生物学行为的影响。（4）筛选miR-539-5p的直接靶基因及验证分析Gene Expression Omnibus（GEO）数据库四组肺腺癌数据集（GSE10072、GSE19188、GSE7670和GSE31210）、获得共同差异基因（Common differentially expressed genes,Co-DEGs）,并与Co-DEmiRNA-DEm RNA调控网络中miR-539-5p靶基因交集、筛选miR-539-5p核心靶基因;GEPIA数据库探讨肺腺癌miR-539-5p核心靶基因的临床价值及并确定直接靶基因,Kaplan Meier plotter和cbioportal等数据库评价直接靶基因及其突变状态在肺腺癌中的临床价值。前述结果确定重组人核糖核苷酸还原酶M2（RRM2）为miR-539-5p直接靶基因。实时荧光定量PCR检测RRM2在正常支气管上皮细胞（BEAS-2B）和3株肺腺癌细胞系（A549、NCI-H1975、SPC-A1）表达情况。RT-PCR和Western-Blot分别检测转染miR-539-5p模拟物、抑制物及各自的阴性对照物调控人肺腺癌A549细胞RRM2 m RNA和蛋白表达。采用RRM2 3′UTR点突变的方法构建含有萤光素酶报告基因的RRM23′UTR Mut（突变型）质粒载体和含有萤光素酶报告基因的RRM2 3′UTR WT（野生型）质粒载体;两者与miR-539-5p mimic和mimic-NC共转染A549细胞,萤光素酶报告基因系统检测A549细胞萤光素酶表达量。（5）miR-539-5p通过抑制RRM2调控肺腺癌细胞恶性生物学行为的机制慢病毒感染人肺腺癌A549细胞系、构建敲减（sh RNA）及过表达（Over-expressed,OE）RRM2稳转A549细胞（即sh RNA＿RRM2和OE＿RRM2细胞株）,RT-PCR和Western-Blot检测细胞RRM2 m RNA和蛋白表达验证慢病毒转染细胞模型是否构建成功;CCK-8、平板克隆实验、划痕实验、Transwell小室法、流式细胞学检测评价sh RNA＿RRM2和OE＿RRM2肺腺癌细胞恶性生物学行为变化证实调控RRM2表达可影响肺腺癌细胞恶性生物学行为;PCR array评价sh RNA＿RRM2能否影响p53及细胞周期通路、并筛选关键基因,Western-Blot评估关键基因蛋白表达;设计“回复”实验,系列功能实验评价miR-539-5p/RRM2参与p53通路、细胞周期通路而调控肺腺癌细胞恶性生物学行为的分子机制。研究结果（1）以p＜0.05和∣log2 FC|＞1为标准、limma程序包分别获得GSE151963和TCGA＿LUAD数据集差异miRNAs和m RNAs,交集得到共同的DEmiRNAs（Co-DEmiRNAs）共30个,包括表达状态一致19个（6个上调和13个下调差异miRNAs）、表达状态不一致11个（GSE151963中2个上调和9个下调DEmiRNAs而TCGA＿LUAD数据集中9个上调和2个下调DEmiRNAs）;19个Co-DEmiRNAs预测得到靶基因5479个,通过4206个DEm RNAs验证得到760个Co-DEm RNAs（包括152个上调和608个下调DEm RNAs）;Cytoscape构建Co-DEmiRNA-DEm RNA网络,包括19个Co-DEmiRNAs和760个Co-DEm RNAs及985条miRNA-m RNA靶向关系。分析得到5个核心miRNAs,包括miR-539-5p（216度）、miR-656-3p（209度）、let-7b-5p（135度）、miR-2110（125度）、和miR-92b-3p（117度）,靶基因功能富集得到836个GO结果和48条KEGG通路。（2）Co-DEmiRNA-DEm RNA调控网络确定miR-539-5p为目标miRNA,实时荧光定量PCR检测显示正常支气管上皮BEAS-2B细胞miR-539-5p表达水平明显高于肺腺癌细胞系（A549、NCI-H1975、SPC-A1）表达,其结果与miR-539-5p在肺腺癌血浆和组织测序一致。（3）miR-539-5p模拟物、抑制物及各自阴性对照物分别转染A549,构建miR-539-5p过表达和表达抑制的肺腺癌细胞模型。CCK-8和平板克隆显示miR-539-5p过表达可抑制肺腺癌细胞的增殖而抑制miR-539-5p表达可促进肺腺癌细胞的增殖;划痕实验和Transwell侵袭小室显示miR-539-5p过表达可抑制肺腺癌细胞迁移和侵袭而抑制miR-539-5p表达可促进肺腺癌细胞迁移和侵袭;Western-Blot显示miR-539-5p过表达可抑制肺腺癌细胞Bcl-2而增加Bax表达、但抑制miR-539-5p表达可增加肺腺癌细胞Bcl-2而降低Bax表达;流式细胞学结果显示miR-539-5p过表达可诱导细胞周期停滞和促进肺腺癌细胞凋亡,而抑制miR-539-5p表达可增加肺腺癌细胞增殖和抑制细胞凋亡,其结果与凋亡相关蛋白（Bcl-2和Bax）表达一致。（4）生物信息学遴选RRM2为miR-539-5p直接靶基因。临床数据显示RRM2在肺腺癌组织高表达、其表达与临床分期正相关;RRM2表达增高提示肺腺癌患者预后差;RRM2在肺腺中呈低频突变/扩增、其突变/扩增状态与肺腺癌预后无关。前述结果确定肺腺癌中探讨miR-539-5p/RRM2的具体作用机制的价值所在。RT-PCR显示正常支气管上皮细胞RRM2表达量明显低于肺腺癌细胞系（A549、NCI-H1975、SPC-A1）表达。RT-PCR和Western-Blot证实miR-539-5p过表达可降低肺腺癌细胞RRM2 m RNA和蛋白表达、而抑制miR-539-5p表达可增加肺腺癌细胞RRM2 m RNA和蛋白表达;萤光素酶双报告基因系统结果证实RRM2为miR-539-5p直接靶基因。（5）RT-PCR和Western-Blot实验证实慢病毒感染人肺腺癌A549细胞,成功构建稳定转染的敲减RRM2（sh RRM2）和过表达RRM2（OE-RRM2）细胞。功能实验发现:CCK-8和平板克隆实验结果显示敲减RRM2可抑制肺腺癌细胞增殖,而过表达RRM2可促进肺腺癌细胞增殖;划痕实验和Transwell侵袭小室结果显示敲减RRM2可抑制肺腺癌细胞迁移和侵袭,而过表达RRM2可促进肺腺癌细胞迁移和侵袭;Western-Blot显示敲减RRM2可抑制肺腺癌细胞Bcl-2而增加Bax表达、过表达RRM2可增加肺腺癌细胞Bcl-2而降低Bax表达;流式细胞学分析结果显示敲减RRM2可促进肺腺癌细胞凋亡,而过表达RRM2可抑制肺腺癌细胞凋亡,其结果与凋亡相关蛋白（Bcl-2和Bax）表达一致。PCR array和Western-Blot显示敲减RRM2可抑制CDC25A、CDC25C、RAD1、PPM1D表达而增加TP53表达。（6）系列回复实验结果显示过表达miR-539-5p可抑制肺A549细胞Bcl-2表达而增加Bax水平、而过表达RRM2可增加A549细胞Bcl-2而降低Bax表达,提示过表达RRM2可减弱miR-539-5p对A549细胞凋亡的促进作用,流式细胞学检测法进一步证实前述结果;回复实验亦证实,过表达RRM2可减弱miR-539-5p对A549细胞增殖、迁移和侵袭能力的抑制。此外,Western-Blot发现过表达miR-539-5p可抑制肺A549细胞CDC25A、CDC25C、RAD1、PPM1D表达、增加TP53表达,而过表达RRM2可增加CDC25A、CDC25C、RAD1、PPM1D表达、抑制TP53表达。回复实验结果证实miR-539-5p抑制肺腺癌恶性生物学行为与其调控RRM2表达相关,具体机制与miR-539-5p/RRM2调控p53和细胞周期通路中关键基因（TP53、CDC25A、CDC25C、RAD1和PPM1D）表达量异常相关。研究结论miR-539-5p在肺腺癌发生、发展中扮演“抑癌miRNA”的作用,其负向调控RRM2表达量而抑制增殖、迁移和侵袭、和诱导细胞周期停滞及促进肺腺癌细胞凋亡。miR-539-5p/RRM2轴有望成为肺腺癌的生物标记物和治疗药物的新靶点。