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TGF-β(transformation growth factor-β,TGF-β)超家族在脊椎动物的生殖、发育、生长等方面都有着重要的作用,Gsdf是TGF-β超家族的新成员,其仅仅在鱼类中存在,并且在大多数的硬骨鱼类的性腺中特异性表达,成为鱼类性别决定基因研究的一个强有力的候选基因,因此本实验对黄河鲤中Gsdf基因从结构到功能进行了初步的研究。本研究首先从实验室构建的黄河鲤(Cyprinus carpio var)转录组库中筛选出Gsdf基因序列,之后通过DNAman比对、Blast搜索、PCR测序验证等方法确定2个正确的全长序列:Gsdf1,全长1444 bp,编码154个氨基酸,有TGF-β结构域以及8个保守的半胱氨酸残基,含有4个外显子和3个内含子;Gsdf2,全长1355 bp,编码191个氨基酸,有TGF-β结构域以及8个保守的半胱氨酸残基,含有5个外显子和4个内含子。氨基酸序列比对结果显示黄河鲤的Gsdf1、Gsdf2和斑马鱼(Barchydanio rerio var)的Gsdf相似性最高,分别为49.3%和57.0%,但是和红鳍东方鲀(Takifugu rubripe)的Gsdf相似性很低,仅有19.9%和24.5%。构建的系统进化树中,黄河鲤的Gsdf1和Gsdf2与斑马鱼的Gsdf基因聚在一枝,这与氨基酸比对结果相一致,推测黄河鲤中Gsdfs基因与斑马鱼的Gsdf基因在进化中关系比较近。染色体同线性分析结果显示在其他硬骨鱼的Gsdf周围存在几个非常保守的基因:NUP54、PPEF2、AFF1和KLHL8,但是黄河鲤中Gsdfs未找到与其邻近的保守基因,推测其可能在进化过程中发生了重排。分析了2个基因5’侧翼上游2000bp序列,发现了Gsdf1和Gsdf2存在多个SOX、FOXL、SF1、SRY等转录因子结合位点,说明黄河鲤中Gsdfs基因可能与性腺发育分化有关。接着,本实验利用qRT-PCR和原位杂交的方法对Gsdf1和Gsdf2在黄河鲤幼鱼及成鱼雌雄各个组织及胚胎发育的不同阶段的表达模式进行分析及定位,结果表明:Gsdf1和Gsdf2主要在性腺中表达,且在性成熟之后,在精巢中的表达量远远高于卵巢中,在胚胎发育初期表达量高之后表达量下调;在成熟性腺中,Gsdf1和Gsdf2在精巢中的阳性信号更加强烈,主要集中在精原细胞周围的支持细胞中,在卵巢中仅在颗粒细胞中有微弱的表达。说明Gsdfs基因可能参与了黄河鲤的性腺发育以及分化,特别是在精巢的发育和分化中起到了重要的作用。miRNA在多种生物细胞的生长以及发育的调节过程中起到重要作用,而随着miRNA调控基因表达研究的逐步深入,miRNA和其靶基因相互作用的研究就显得更加重要。因此本实验结合实验室构建的黄河鲤的性腺miRNA库利用Targetscan预测到Gsdf1是miR-22a和miR-210的潜在靶基因。为了研究Gsdf1与这两个miRNA之间的调控关系,先利用双荧光素酶报告基因检测系统验证了黄河鲤中两者与Gsdf1的靶标关系,结果表明Gsdf1是miR-22a和miR-210的潜在靶标基因。最后本实验成功制备了黄河鲤的Gsdf1基因的多克隆抗体,并利用抗体进行了蛋白质免疫印迹(Western Blot)和酶联免疫分析(Elisa)对miR-22a和miR-210以及Gsdf1之间的靶标关系进行了双重验证,再一次证明了黄河鲤中Gsdf1是miR-22a和miR-210的靶标基因。推测miR-22a和miR-210可能通过对Gsdf1的调控参与到了黄河鲤的性别分化和发育中去,但具体的机制还需要更进一步的研究。综上所述,我们推测,黄河鲤中Gsdfs基因在性腺发育、分化中起到重要的作用,这对研究黄河鲤性别的发育和分化的进程、深入研究黄河鲤精巢发育的分子机制有着非常重要的意义,同时可能会对鱼类的性别决定机制的探索提供一定的帮助。