研究背景结肠癌(Colon cancer)是胃肠道最常见的恶性肿瘤之一,位居全球肿瘤发病率的第3位。随着生活水平的提高,我国结肠癌的发生率和死亡率呈逐年上升趋势,且发病年龄明显提前。目前,手术切除辅以化疗和放疗是治疗结肠癌最常见的方式,但约有半数的患者会发生术后复发和转移,术后复发和转移是造成结肠癌患者死亡的主要原因。因此,阐明结肠癌复发和转移的分子机制是改善结肠癌患者预后至关重要的一步。肿瘤组织中存在少量的具有自我更新和分化潜能特性的肿瘤干细胞(Cancer stem cells,CSCs),CSCs被认为在肿瘤复发和转移过程中起着关键性作用,是肿瘤生长、转移和复发的根源。已证实,结肠癌组织中存在CSCs。因此,靶向结肠癌干细胞可能是临床复发转移结肠癌治疗的有效途径。Sohlh2(Spermatogenesis and oogenesis basic helix-loop-helix transcription factor 2)是碱性螺旋-环-螺旋(bhlh)转录因子超家族成员,它可以与靶基因启动子区域结合,调控靶基因的表达,参与细胞增殖、分化和迁移等细胞行为。已证实,bhlh转录因子的异常表达与多种肿瘤发生相关。前期实验结果已证实,sohlh2是一个新的抑癌基因,可抑制乳腺癌和结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭。预实验结果显示,结肠癌干细胞中sohlh2表达明显下调,提示sohlh2可能参与结肠癌干细胞增殖分化的调控。本研究中,我们将探讨sohlh2在结肠癌干细胞扩增中的作用和作用机制。Wnt/β-catenin信号通路调控细胞增殖和干细胞的自我更新,其异常激活在结肠癌发生发展中起着十分重要的作用。β-catenin是Wnt信号通路的关键分子,它可入核与TCF/LEF转录因子结合,促进其下游靶基因c-myc、cyclinD1表达,有助于结肠癌的生长以及CSCs的维持。β-catenin表达增加提示结肠癌患者预后不良,干扰β-catenin表达可抑制结肠癌的进展。长链非编码RNA(Long non-coding RNA,LncRNA)在肿瘤侵袭和转移过程中发挥关键性的调控作用。LncRNA-H19是最早报道的LncRNA之一,在多种肿瘤中高表达,可作为竞争性内源RNA结合miR-141,上调β-catenin的表达,激活β-catenin下游信号通路,促进结肠癌细胞的侵袭和转移。实验室前期研究证实sohlh2在结肠癌中抑制Wnt/β-catenin信号通路,LncRNA高通量测序结果显示,过表达sohlh2可下调LncRNA-H19的表达。因此,我们提出科学假设,sohlh2可能通过下调LncRNA-H19转录,抑制Wnt/β-catenin信号通路,参与结肠癌干细胞扩增的调控。研究方法:1.结肠癌干细胞的分离培养与鉴定在低粘附性培养皿中,无血清培养人和小鼠结肠癌细胞HCT116和CT26。培养5-7天后,收集细胞球,进行传代、冻存、复苏。利用免疫荧光染色和FACS,鉴定在无血清培养基中富集到的细胞是否为结肠癌干细胞。2.研究sohlh2对结肠癌干细胞扩增的影响体外培养结肠癌细胞HCT116和CT26,慢病毒转染构建过表达sohlh2和敲减sohlh2的稳转细胞株,无血清悬浮培养法富集CSC克隆球。通过克隆球形成、软琼脂集落形成、CCK-8、免疫荧光染色、FACS实验方法,检测sohlh2对结肠癌干细胞扩增的影响。3.检测sohlh2对结肠癌干细胞标记分子表达的影响通过q-PCR、Western-blot实验,检测sohlh2对结肠癌干细胞标记分子Oct4、sox2、CD44、CD133、Lgr5 表达的影响。4.在体实验研究sohlh2对结肠癌干细胞皮下成瘤的影响富集HCT116、CT26高表达Sohlh2及相应对照细胞系的结肠癌干细胞,分别注射到裸鼠和BALB/c小鼠皮下,定期量取皮下肿瘤大小,绘制皮下肿瘤生长曲线。1个月后处死小鼠,取皮下肿瘤,称重、拍照,4%多聚甲醛固定,进行Lgr5、CD133免疫组化染色,在体实验检测sohlh2对结肠癌干细胞皮下成瘤的影响。5.研究sohlh2是否通过调控LncRNA-H19转录抑制Wnt/β-catenin信号通路在结肠癌干细胞和皮下肿瘤瘤体组织中,通过q-PCR和Western-blot实验,检测sohlh2对结肠癌干细胞及皮下肿瘤瘤体组织中LncRNA-H19、miR-141、β-catenin、c-myc、cyclin D1表达的影响;通过ChIP、双荧光素酶报告实验,探究sohlh2是否可以直接调控LncRNA-H19转录;通过转染LncRNA-H19过表达质粒,探究LncRNA-H19是否阻断sohlh2抑制结肠癌干细胞标志物表达和Wnt/β-catenin信号通路激活的作用。6.研究临床结肠癌样本中,sohlh2与Lgr5、CD133表达的相关性利用结肠癌组织芯片,通过免疫组化染色,分析结肠癌组织中sohlh2与Lgr5、CD133表达的相关性。研究结果:1.结肠癌干细胞的分离培养与鉴定采用无血清悬浮培养法,在人和小鼠结肠癌细胞系中成功富集CSC克隆球;CSC克隆球可传代、冻存、复苏。经q-PCR、免疫荧光、FACS鉴定,确定无血清悬浮培养成功富集到的结肠癌干细胞表达CSC表面标记物Lgr5、CD133。2.Sohlh2抑制结肠癌干细胞扩增克隆球形成、软琼脂集落形成实验结果显示:过表达sohlh2组,结肠癌干细胞球的大小和数目明显小于对照组(p<0.001);敲减sohlh2组,干细胞球的大小和数目明显大于敲减对照组(p<0.01)。免疫荧光结果显示:过表达sohlh2抑制结肠癌干细胞表面标记物Lgr5、CD133的表达;敲减sohlh2,Lgr5、CD133表达上调。CCK-8结果显示:过表达sohlh2抑制结肠癌干细胞的扩增;敲减sohlh2,则结果相反。FACS检测结果显示:过表达sohlh2组,Lgr5和CD133双阳性的结肠癌干细胞比例明显低于对照组(p<0.001);敲减sohlh2组,Lgr5和CD133双阳性的结肠癌干细胞比例明显高于对照组(p<0.01)。3.Sohlh2抑制结肠癌干细胞标记分子Oct4、sox2、CD44、CD133、Lgr5表达q-PCR、Western-blot结果显示:过表达sohlh2下调结肠癌干细胞标记分子Oct4、sox2、CD44、CD133、Lgr5表达;敲减sohlh2,上述基因表达较对照组明显上调(p<0.01)。4.在体实验研究sohlh2抑制结肠癌干细胞皮下成瘤能力裸鼠和BALB/c小鼠皮下成瘤实验结果显示:sohlh2抑制结肠癌干细胞的皮下成瘤能力。免疫组化结果显示:与对照组相比,Sohlh2组皮下成瘤组织中的Lgr5、CD133表达明显降低。5.Sohlh2通过调控LncRNA-H19转录抑制Wnt/β-catenin信号通路q-PCR和Western-blot结果显示:sohlh2下调结肠癌干细胞和裸鼠皮下瘤组织中的β-catenin及其靶基因c-myc、cyclin D1的表达;敲减sohlh2,β-catenin及其靶基因c-myc、cyclin D1的表达上调。过表达sohlh2下调LncRNA-H19的mRNA水平,上调miR-141mRNA水平;敲减sohlh2则结果相反。ChIP、双荧光素酶报告实验结果证实:sohlh2可以直接结合到LncRNA-H19的启动子区域并抑制其转录活性;敲减sohlh2,则促进其转录活性。结肠癌细胞转染 LncRNA-H19 过表达质粒后,q-PCR、Western-blot 结果显示:LncRNA-H19可部分阻断sohlh2对结肠癌干细胞标记物、β-catenin及其靶基因表达的抑制作用。6.研究临床结肠癌样本中,sohlh2与Lgr5、CD133表达呈负相关结肠癌组织芯片免疫组化结果显示,sohlh2的表达与Lgr5、CD133的表达呈负相关。结论:1.Sohlh2可抑制结肠癌干细胞的扩增。2.Sohlh2通过下调LncRNA-H19转录,抑制β-catenin下游信号通路,来发挥作用的。