甘蔗黑穗病是一种由黑粉菌(Sporisorium scitamineum)引起的真菌病害。培育和推广抗黑穗病甘蔗品种是控制该病害的最有效方法。长期以来,人们从细胞学、形态学、生理生化抗性和分子互作机制等方面开展了诸多研究,证明甘蔗与黑穗病菌的互作是一个复杂的网络系统。本研究立足于甘蔗对黑穗病菌侵染的应答反应的全方位和多角度研究,首先,通过研究黑穗病菌在蔗芽组织中的数量及活性氧代谢途径和苯丙烷代谢途径关键酶活性的变化,分析甘蔗与黑穗病菌互作的时间点,以更准确地了解甘蔗有效应答黑穗病菌侵染的时间和强度,确定互作的关键时间点；其次,利用降解组测序技术鉴定受miRNA剪切调控的靶标基因,分析靶标基因的降解位点,结合靶标基因的差异表达及功能分类,挖掘与抗病相关的靶标基因；最后,对所筛选的差异靶标基因及其对应的miRNA进行qRT-PCR表达分析,通过它们的表达趋势和模式,进一步确定niRNA的剪切调控作用,并分析靶标基因所涉及的代谢通路,以便进一步了解甘蔗应答黑穗病菌侵染的响应机制,为基于分子生物学技术改良甘蔗品种的抗黑穗病性提供靶标基因及其相应的miRNA资源。主要研究结果如下：1.以YC05-179(抗黑穗病甘蔗品种)和ROC22(感黑穗病甘蔗品种)为研究材料,接种黑穗病菌(处理组)和无菌水(对照组)0 d、1 d、2 d、3 d、5 d、7d后,采用荧光定量PCR技术检测蔗芽组织中黑穗病菌的菌量变化情况,并测定活性氧代谢途径关键酶(POD、 SOD和CAT)和苯丙烷代谢途径关键酶(PPO、PAL和TAL)的活性变化。结果表明,接种黑穗病菌后,无论是YC05-179或是ROC22,蔗芽组织中黑穗病菌的菌量都随接种时间的延长而增加,且ROC22中的菌量多于YC05-179相应取样时间点的菌量。此外,接种黑穗病菌后,YC05-179中POD、 SOD和CAT的活性普遍比对照高,POD和CAT的活性也明显高于ROC22的相应取样时间点,且活性峰值较早出现,表明YC05-179中活性氧代谢途径强度比ROC22相应时间点高,能够更早应答黑穗病菌的侵染。与此同时,接种黑穗病菌后,苯丙烷代谢途径入口以TAL催化的通路为主,代谢途径较弱,随着接种时间的延长,PAL和TAL共同发挥作用,使得苯丙烷代谢途径增强,且YC05-179中由PAL催化的通路启动较快。接种5d时,蔗芽组织中活性氧代谢途径和苯丙烷代谢途径都较强,2d和3d次之,结合黑穗病菌的菌量在两个品种接种2d时即出现明显差异,故认为接种2d和5d是研究甘蔗与黑穗病菌互作过程中靶标基因降解组测序的最佳时间点。2.以YC05-179和ROC22的蔗芽组织为研究材料,以接种无菌水0d的为对照,对接种黑穗病菌2 d和5 d的蔗芽进行降解组测序分析。6个样品共得到122.33 M原始数据量,经数据评估后,各样品的Q30在93%以上,且用于下游降解位点分析的序列与甘蔗的参考序列完全匹配,表明降解组测序质量较高。6个甘蔗样品共检测到309个靶]mRNA,分别与97个己知miRNA和112个新miRNA相呼应,并鉴定了337处降解位点,表明miRNA能够有效剪切调控靶标基因的多个位点。靶标基因以Category 0为主,涉及生命活动的多种调控过程,如信号转导机制(Signal transduction mechanisms),离子转运机制(Inorganic ion transport and metabolism)、防御机制(Defense mechanisms)、翻译及翻译后修饰(Translation, posttranslational modification)、能量的产生与转导(Energy production and conversion)、甘油酯类代谢(Glycerolipid metabolism)等。GO分析表明,两个甘蔗品种中差异表达的靶标基因的靶向分类基本一致,涉及到细胞(Cell)、膜(Membrane)、细胞器(Organelle)和细胞部分(Cell part)等细胞成分(Cellular component)、主要发挥催化活性(Catalytic activity)和结合(Binding)功能,可参与代谢过程(Metabolic process)、细胞生理过程(Cellular process)、单生物过程(Single-organism process)、应答刺激(Response to stimulus)、生物学调控(Biological regulation)、免疫系统过程(Immune system process)和信号途径(Signaling)等。KEGG富集分析显示,差异表达靶标基因参与植物激素信号转导途径(Plant hormone signal transduction),辅酶Q和其他萜醌类化合物生物合成(Ubiquinone and other terpenoid-quinone biosynthesis)、泛素介导的蛋白降解途径(Ubiquitin mediated proteolysis)、植物与病原菌互作途径(Plant-pathogen interaction)、氧化磷酸化作用(Oxidat ive phosphorylat ion)、过氧化物酶体途径(Peroxisome)、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸生物合成途径(Phenylalanine, tyrosine and tryptophan biosynthesis)、吞噬体(Phagosome)等与抗病性相关的代谢通路。3.差异表达靶标基因及其对应miRNA的qRT-PCR表达分析。靶标基因和它们对应的miRNA至少在一个甘蔗品种中表达模式相反,这种表达模式正符合miRNA对靶标基因的剪切作用。CCR参与木质素生物合成途径,在接种后表达量升高,有助于木质素的合成与累积,有效应答黑穗病菌的侵染；UCH-L5与泛素介导的蛋白降解途径密切相关,也可参与应答黑穗病菌的侵染；GK、 MLO和HIR1参与植物与病原菌的互作途径,其中,GK具有NHO1活性,其表达量的升高可以增强甘蔗对黑穗病菌的抗性；此外,MLO还参与了钙离子通路,与植物的抗病性表现出负相关；MLO基因的表达,在接种黑穗病菌后下降,减轻了MLO蛋白对防卫反应的抑制作用；HIR参与植物的过敏反应,接种黑穗病菌后,HIR1上调表达,蔗芽组织可以较早的发生过敏反应,以限制黑穗病菌的继续扩展侵染；EIL3是乙烯信号途径的转录因子,接种黑穗病菌后表达上调,使乙烯代谢途径增强,有利于抵御黑穗病菌的侵染；ARF和AIP参与生长素信号途径,接种黑穗病菌后,ARF8下调表达,且YC05-179中ARF8的下降幅度比ROC22小,而AIP上调表达,且表达量的上升幅度比ROC22大,表明生长素信号途径可以应答黑穗病菌侵染；此外,GRF8的下调表达,说明黑穗病菌的侵染在一定程度上抑制了甘蔗本身的生长；SAMDC参与多胺的生物合成,黑穗病菌侵染后,SAMDC的表达增强,表明黑穗病菌的侵染可以促使多胺代谢途径增强；MYB是典型的抗病相关转录因子,MYB2在两个品种中的表达趋势不同,且在两个品种中的应答时间不同,表明MYB2对黑穗病菌侵染的应答能力与甘蔗基因型的抗黑穗病性相关;AGO IB在两个品种中表达模式相反,其中,YC05-179接种后表达下调,可以累积更多受miRNA剪切调控的抗病相关靶标基因,推测miRNA的反馈调节参与了甘蔗对黑穗病菌侵染的应答反应。然而,由于qRT-PCR分析时AGO 1B, PP2C6, HIR1、 AIP和SAMDC的表达模式与降解组测序的结果有一定的差异,所以还需后续实验来进一步验证它们在甘蔗应答黑穗病菌侵染时所发挥的作用。