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传染性海绵状脑病(Transmissible Spongiform Encephalopathies，TSE)是发生于人及其它动物上的一类致命的传染性中枢神经系统退行性疾病，主要包括:羊搔痒病，牛海绵状脑病（即疯牛病），人克雅氏病(CJD)、GSS综合症、致死性家族失眠症(FFI)等。 动物基因组编码的朊蛋白(PrP)是与TSE发生直接相关的因子。研究证明内源性PrP存在是发生TSE的必要条件，缺失PrP的小鼠具有抵抗TSE的能力，但一些朊蛋白基因敲除小鼠出现了诸如嗅觉异常、生物周期紊乱等异常现象。作为自然宿主的动物如羊、牛等，PrP的缺失或下调是否具有抵抗TSE的能力？是否会产生类似朊蛋白基因敲除小鼠的异常现象？因此，建立PrP表达水平不同程度下调的转基因动物（羊或牛）模型，对上述问题的分析具有十分重要的意义。 RNA干扰(RNA interference，RNAi)是近年来发展起来的基因转录后调控技术，利用RNAi抑制特定基因的表达在哺乳动物细胞及转基因小鼠中有了较为广泛的研究。本文拟利用RNAi抑制山羊PrP的表达，获得内源性PrP被不同程度下调的山羊胎儿成纤维细胞，并通过体细胞克隆的方法建立PrP低表达的山羊动物模型。本文主要从以下三个方面进行研究。 一、基于293T细胞的RNAi靶序列的筛选及对pGFP-PrP抑制效率的研究。 本研究的目的是在293T细胞水平上筛选获得有效的RNAi序列。通过在线软件设计了基于山羊朊蛋白基因(PRNP)的干扰靶序列，构建了以U6为启动子的含不同靶siRNA序列的shRNA(short hairpin RNA)干扰载体14个，并以pGFP-PrP为报告基因，将各干扰载体与pGFP-PrP共转染293T细胞，通过观察报告基因的荧光强弱分析各干扰载体的抑制能力的差异。同时，再利用real-time PCR分别对各转染细胞中PrP表达量进行了定量分析。上述研究结果表明，14个shRNA干扰载体中，有7个载体(分别是pU6-A、pU6-D、pU6-E、pU6-I、pU6-K、pU6-M、pU6-N)转染后绿色荧光表达明显减弱，并能有效的抑制转染细胞中PrP的表达。另外，pU6-A、pU6-B还对小鼠神经瘤细胞Neuro2a中的PrP有一定的抑制作用，而以人CMV基因及山羊PRNP基因为启动子的shmiRNA表达载体也能有效的抑制293T细胞中pGFP-PrP的表达。 二、基于山羊胎儿成纤维细的各shRNA对内源性PrP的抑制研究。 根据上述研究结果，选择了对293T细胞中pGFP-PrP的表达具有显著抑制作用的shRNA干扰载体pU6-D、pU6-E、pU6-I、pU6-M，分别转染山羊胎儿成纤维细胞，通过加入嘌呤霉素抗性筛选获得了整合有目的干扰载体的山羊胎儿成纤维单克隆细胞。再利用real-time PCR对各细胞克隆中PrP mRNA进行了定量检测，结果显示此四个干扰载体都能有效的抑制山羊成纤维细胞内源性的PrP的表达，其转染后各细胞克隆的抑制效率从24.8±0.5％到94.0±1.5％不等。研究结果还发现不仅整合有不同干扰载体的细胞克隆内源性PrP抑制水平不同，而且，来自同一干扰载体转染后获得的不同细胞克隆的内源性PrP mRNA被抑制的程度也不一样（如来自pU6-D载体的7个细胞株中，抑制率分别为D1，74.6±1.2％;D2,64.6±3.8％;D5,55.0±1.1％;D8,45.6±7.2％;D9,68.8±1.0％;D10,24.8±0.5％;D11，48.9±1.1％.），其原因可能是由于整合位点的不同及拷贝数的差异所引起的。 三、体细胞核移植制备RNAi转基因克隆羊及对克隆羊的RNAi分析。 根据上述一、二的研究结果，结合转染后的细胞生长状态，筛选出四株细胞用于核移植羊的制备，分别是pU6-D整合的D1(抑制率为64.6±3.8％)及D2(抑制率为75.6±1.2％)，pU6-E整合的E13(抑制率为93.0±4.1％)，pU6-M整合的M2(抑制率为87.1±1.5％)，共获得怀孕羊20个，目前已出生存活克隆羊1头。对以D1为核供体的65日龄的克隆羊胎儿的检测结果显示其脑中的PrP得到了有效的抑制，其抑制率（55.1±5.8％）与D1细胞相似。该结果显示基于山羊胎儿成纤维细胞的检测体系可较好的模拟山羊体内的RNA干扰水平，根据四个供体细胞的PrP抑制水平，我们有希望获得内源性的PrP被相应下调的克隆羊。 结论:本研究首次建立了RNAi抑制内源性PrP表达的山羊模型。筛选出了高效的靶向山羊PRNP基因的siRNA片段，建立了基于山羊胎儿成纤维细胞的RNAi效率检测体系，获得了内源性PrP不同程度下调的山羊胎儿成纤维细胞，并通过体细胞核移植获得了存活的RNAi转基因克隆羊。上述结果表明以U6为启动子的非病毒表达框架的RNA干扰载体可有效的抑制内源性PrP表达，建立的RNAi山羊模型为TSE的基础研究和应用研究提供了保障。