斑马鱼低氧应答基因TGF-β1的表达特征及功能分析

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低氧现象是池塘、水库、湖泊及近海季节性发生的一种自然现象。近年来,水体富营养化致使低氧现象频繁发生,水体低氧问题已成为制约水产养殖可持续发展的主要因素之一。因此,开展鱼类耐低氧分子机制研究具有重要的理论意义和实践价值。  转化生长因子-β1(TGF-β1)是一种多功能细胞因子,参与调节多种细胞活动,具有重要的生物学功能。在前期实验中,我们利用抑制消减杂交技术从鲫鱼囊胚细胞中筛选到低氧应答基因TGF-β1。在此基础上,本研究利用斑马鱼活体实验体系,初步研究了TGF-β1基因的表达特征及其在低氧适应中的功能。取得的主要结果如下:  本研究通过NCBI获得斑马鱼TGF-β1基因cDNA序列。斑马鱼TGF-β1 cDNA全长1571bp,编码377个氨基酸。系统进化树分析发现,TGF-β蛋白按照不同的类型严格聚类,斑马鱼TGF-β1与其他鱼类的TGF-β1聚集到一个分支,在进化中非常保守。在斑马鱼胚胎发育过程中,RT-PCR和Real-Time PCR结果显示TGF-β1基因为母源表达基因,在分节期之前的表达水平比较低,从咽囊期开始持续高水平表达。胚胎整体原位杂交发现,TGF-β1基因在斑马鱼24hpf胚胎中开始有特异信号出现。TGF-β1基因的表达主要分布在腮弓、侧线原基、耳囊、嗅觉基板、心脏和前肾等处。这些结果表明TGF-β1基因可能参与斑马鱼胚胎的免疫调节、循环系统发育和侧线形成。  用低氧处理斑马鱼胚胎,发现低氧处理24小时后斑马鱼胚胎发育延迟。利用Real-Time PCR和原位杂交检测发现,低氧处理后发育延迟的斑马鱼胚胎中TGF-β1mRNA表达水平较常氧组显著降低。RT-PCR和Real-Time RT-PCR结果显示,TGF-β1基因在斑马鱼健康成鱼各个组织器官中广泛表达。TGF-β1的mRNA水平在斑马鱼成鱼眼、脑、腮、心脏、肝脏、精巢和卵巢等多个组织器官中被低氧显著诱导。利用PCR技术扩增斑马鱼TGF-β1ORF序列,将其连接到pEGFPN1载体上,构建重组质粒pEGFPN1-TGF-β1。将构建好的pEGFPN1-TGF-β1质粒和对照质粒pEGFPN1分别转染HEK293细胞,然后对瞬时转染的细胞进行低氧处理,用MTT法检测细胞活力,结果发现转染pEGFPN1-TGF-β1载体细胞的生存活力明显高于转染pEGFPN1载体的细胞。上述结果表明,TGF-β1基因可能在鱼类低氧适应方面发挥一定的保护作用。
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