九州虫草子座多糖的分离纯化,理化性质、结构及抗氧化活性测定

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虫草多糖作为虫草中主要活性成分之一,具有免疫调节、抗肿瘤、抗病毒、抗炎、降血压、抗氧化抗衰老等一系列活性功能。冬虫夏草作为虫草中最名贵的一种,近年来由于过度开采利用,资源已经匮乏,不足以支撑人们开发利用,所以近年来人们积极寻找替代虫草,降低对冬虫夏草的依赖。九州虫草,首发现于山东蒙山,是一种以豆天蛾幼虫为寄主的虫草,已经能进行人工培养。作为一种新近发现的虫草种类,对其子座多糖的研究依然还未进行,因此本文以九州虫草子座作为研究对象,提取纯化了其部分多糖,并对多糖理化性质、结构、水溶液构象变化以及抗氧化潘性进行了检测与分析。本实验以人工培养的九州虫草子座为材料,通过水提醇沉、sevag法除蛋白等一系列操作得到粗多糖(CK),得率为3.8%;粗多糖经过乙醇分级沉淀,分别收集乙醇水溶液浓度为15%、30%、50%的三部分沉淀多糖以及50%时上清液中的多糖,共部分,分别为CK-1、CK-2、CK-3、CK-4,得率分别是0.267%、0.714%、0.499%、2.26%。将制得的CK-4经凝胶柱G-100以及离子交换柱DE-23分离纯化,制得八种多糖,分别命名为CK-4A1、CK-4A2、CK-4A3、CK-4B1、CK-4B2、CK-4B3、CK-4B4、CK-4C;对其中产量较多的CK-4B2、CK-4B3、CK-4B4以及CK-4C进行了纯度鉴定,以便下一步的理化性质和抗氧化功能的检测。对提取得到的多糖CK-4B2、CK-4B3、CK-4B4、CK-4C理化性质检测发现,四种多糖的糖含量分别是37.93%、5.58%、5.11%、3.76%,其中CK-4B2中含有24.7%的糖醛酸,其余只有微量糖醛酸;而CK-4B3中含有37.8%的蛋白,CK-4C中有微量蛋白质,其余则不含蛋白;四种多糖均未检测到硫酸根存在。四种多糖的分子量分别达到807KDa、467KDa、373KDa、388KDa,经红外光谱鉴定,四种成份中均含有多糖的特征官能团;经PMMP衍生,HPLC-UV检测发现四种多糖含有的单糖及比例分别是Fuc:Man:Rham:GalN:Ara=1:1.19:0.11:0.11:0.34, Fuc:Man:Rham:Glu:Gal:Ara=1:1.69:0.27:0.07:0.07:0.09,Fuc:Man:Rham: Glu:Gal=1:0.25:0.46:0.14:0.09,Fuc:Man:Rham:GalN:Ara=1:0.10:0.07:0.02:0.02;通过对CK-484水溶液的紫外光谱扫描和圆二色谱扫描发现,发现CK-484在酸性条件下会导致CK-484分子的不对称性增强,但不会引起多糖构象的突变,但在碱性条件下,多糖能发生β-消去反应而使多糖构象发生突变;CK-484加热后,会使CK-484产生变性与复性的部分可逆过程,即分子不对称性增强和减弱的过程;在Ca2+、K+、H3B03存在下也发现会对CK-4B4分子不对称性产生影响,且跟浓度有一定的关系,本文根据蛋箱模型解释了其产生变化的原理;对提取的多糖进行了抗氧化活性的测定,包括粗多糖CK,乙醇分级沉淀产生的粗多糖CK-1、CK-2、CK-3、CK-4以及纯多糖CK-4B2、CK-4B3、CK-4B4共八种多糖,包含五种抗氧化体系,分别是超氧阴离子清除率、DPPH自由基清除率、羟基自由基清除率、Fe2+螯合清除能力、总还原力。检测结果显示:对于超氧阴离子清除能力、羟基自由基清除能力、Fe2+络合清除能力以及总还原力,在粗多糖中,抗氧化能力最强的分别是CK-4、CK、CK-1、CK,清除率分别达到了15%,100%,90%,以及总还原力吸光度1;而在纯多糖中,最强的分别是CK-4B4、CK-4B2、CK-4B4、CK-4B4,清除率分别达到了18%、100%、30%、以及总还原力0.7;而对于DPPH自由基,发现所有的粗多糖组分以及纯多糖组分均不能有效的对其进行清除。从抗氧化检测结果中分析发现:在纯多糖的抗氧化活性测定中,发现CK-4B4具有最高的超氧阴离子清除率、Fe2+络合清除能力以及总还原力,且羟基自由基的清除率也高达88%,所以其综合抗氧化能力非常突出,且分离得到的产量较大,具有一定的开发利用价值。通过多糖在双氧水脱色处理前后的抗氧化活性对比发现,经双氧水脱色处理后的多糖在超氧阴离子清除率、DPPH自由基清除率、羟基自由基清除率、总还原力四个方面均有明显降低,但在Fe2+螯合清除能力上有所提高,故推测双氧水能氧化多糖中的一CHO变成—COOH。
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