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目的：糖尿病足溃疡(Diabetic foot ulcer，DFU)是一种慢性难愈性溃疡，疾病发展周期长，常表现为皮肤干燥皲裂、足部浅表溃疡，足背动脉及胫后动脉搏动逐渐减弱甚至消失，并可听到血管杂音，严重者可导致截肢或者发展为脓毒血症危及生命，严重危害着人们的身心健康。因此，深入研究DFU的发生发展机制，具有重要的意义。大量的研究发现，炎症微环境在DFU的发生发展中发挥着重要作用，并且NF-κB信号通路参与了创面炎症微环境炎性因子的释放，NF-κB信号通路在受到外来因素刺激后被激活，活化的NF-kB因子转位到核内与与其相关的DNA基序结合以诱导靶基因转录，从而释放大量炎性因子。我们在前期实验中已成功制备出白及胶/微米三七粉含药血清，并经实验证实不同含量配比的白及胶/微米三七粉含药血清均可以抑制DFU创面炎症微环境模型中巨噬细胞的增殖以及炎性因子的释放。本研究拟在前期实验研究的基础上，通过体外培养小鼠腹腔单核巨噬白血病细胞(RAW264.7)，使用脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)诱导建立细胞炎症损伤模型，探讨白及胶/微米三七粉对DFU创面的炎症微环境模型中巨噬细胞(MΦ)活化、炎性因子的调节作用，以及对巨噬细胞核转录因子κB(Nuclearfactorkappa-B，NF-κB)信号通路异常活动的调控作用。
方法：第一部分：检测LPS诱导巨噬细胞增殖反应与白及胶/微米三七粉含药血清作用的最佳浓度。1.细胞分组为正常对照组、不同浓度的LPS(5、10、15、20、25μg/)mL组。使用CCK-8法检测LPS诱导RAW264.7细胞增殖反应的最佳浓度。2.细胞分组为正常对照组、LPS组、LPS+不同浓度的含药血清(50、100、150、200、250、300μL/mL)组。使用CCK-8法检测白及胶/微米三七粉含药血清作用于LPS诱导的RAW264.7细胞炎性反应的最佳浓度。第二部分：白及胶/微米三七粉抑制LPS诱导RAW264.7巨噬细胞分泌炎性因子。细胞分组为为正常对照组、空白血清组、含药血清组、LPS组、LPS+空白血清组、LPS+含药血清组。使用ELISA法检测白及胶/微米三七粉对LPS诱导RAW264.7巨噬细胞分泌的炎性因子IL-1β与iNOS的作用。第三部分：白及胶/微米三七粉抑制LPS诱导RAW264.7巨噬细胞产生炎性反应的机制。细胞分组为为正常对照组、空白血清组、含药血清组、LPS组、LPS+空白血清组、LPS+含药血清组。采用WesternBlot法检测白及胶/微米三七粉干预LPS诱导RAW264.7巨噬细胞炎性反应后细胞胞核NF-κBp65蛋白与细胞胞浆NF-κBp65、p-IκBα蛋白的表达。
结果：第一部分：检测LPS诱导巨噬细胞增殖反应与白及胶/微米三七粉含药血清作用的最佳浓度。1.不同浓度LPS(5、10、15、20、25μg/mL)诱导RAW264.7巨噬细胞发生增殖反应。与正常对照组相比，浓度为5、15、20μg/mL的LPS对RAW264.7巨噬细胞增殖作用较为明显(P＜0.05)；浓度为10μg/mL的LPS对RAW264.7巨噬细胞增殖作用显著明显(P＜0.01)。2.在白及胶/微米三七粉含药血清干预LPS诱导的炎症模型24h后，浓度为100、150、200、300μL/mL的白及胶/微米三七粉含药血清抑制LPS诱导的炎症模型的增殖作用较为明显(P＜0.05)。浓度为250μL/mL的白及胶/微米三七粉含药血清抑制LPS诱导的炎症模型的增殖作用显著明显(P＜0.01)。第二部分：白及胶/微米三七粉抑制LPS诱导RAW264.7巨噬细胞分泌炎性因子。检测白及胶/微米三七粉对LPS诱导RAW264.7巨噬细胞分泌的炎性因子IL-1β与iNOS的作用。与正常对照组相比，LPS显著地诱导RAW264.7巨噬细胞分泌IL-1β、iNOS炎性细胞因子(P＜0.01)。较LPS组相比，白及胶/微米三七粉可明显抑制炎性因子IL-1β、iNOS的分泌(P＜0.01)。第三部分：白及胶/微米三七粉抑制LPS诱导RAW264.7巨噬细胞产生炎性反应的机制。白及胶/微米三七粉对细胞胞浆NF-κBp65、p-IκBα蛋白表达和细胞胞核NF-κBp65蛋白表达的影响。较空白对照组相比，LPS组巨噬细胞胞浆NF-κBp65蛋白表达量明显降低(P＜0.01)，与LPS组相比，LPS+含药血清组巨噬细胞胞浆NF-κBp65蛋白表达量明显升高(P＜0.01)；较空白对照组相比，LPS组巨噬细胞胞核NF-κBp65蛋白表达量明显升高(P＜0.01)，与LPS组相比，LPS+含药血清组巨噬细胞胞核NF-κBp65蛋白表达量明显降低(P＜0.01)；说明白及胶/微米三七粉可明显抑制LPS诱导的NF-κBp65核转移。较空白对照组相比，LPS组细胞胞浆p-IκBα蛋白表达量明显增加(P＜0.01)，较LPS组相比，LPS+含药血清组巨噬细胞胞浆p-IκBα蛋白表达量明显降低(P＜0.01)，说明白及胶/微米三七粉可明显抑制LPS诱导的p-IκBα蛋白的表达。
结论：1.白及胶/微米三七粉可以有效降低细胞炎症模型中炎性因子的表达，减轻局部炎症反应，改善炎症微环境。2.白及胶/微米三七粉可以抑制NF-κB信号通路中NF-κBp65蛋白进入细胞核和IκBα蛋白的磷酸化，从而抑制巨噬细胞分泌炎性因子。
方法：第一部分：检测LPS诱导巨噬细胞增殖反应与白及胶/微米三七粉含药血清作用的最佳浓度。1.细胞分组为正常对照组、不同浓度的LPS(5、10、15、20、25μg/)mL组。使用CCK-8法检测LPS诱导RAW264.7细胞增殖反应的最佳浓度。2.细胞分组为正常对照组、LPS组、LPS+不同浓度的含药血清(50、100、150、200、250、300μL/mL)组。使用CCK-8法检测白及胶/微米三七粉含药血清作用于LPS诱导的RAW264.7细胞炎性反应的最佳浓度。第二部分：白及胶/微米三七粉抑制LPS诱导RAW264.7巨噬细胞分泌炎性因子。细胞分组为为正常对照组、空白血清组、含药血清组、LPS组、LPS+空白血清组、LPS+含药血清组。使用ELISA法检测白及胶/微米三七粉对LPS诱导RAW264.7巨噬细胞分泌的炎性因子IL-1β与iNOS的作用。第三部分：白及胶/微米三七粉抑制LPS诱导RAW264.7巨噬细胞产生炎性反应的机制。细胞分组为为正常对照组、空白血清组、含药血清组、LPS组、LPS+空白血清组、LPS+含药血清组。采用WesternBlot法检测白及胶/微米三七粉干预LPS诱导RAW264.7巨噬细胞炎性反应后细胞胞核NF-κBp65蛋白与细胞胞浆NF-κBp65、p-IκBα蛋白的表达。
结果：第一部分：检测LPS诱导巨噬细胞增殖反应与白及胶/微米三七粉含药血清作用的最佳浓度。1.不同浓度LPS(5、10、15、20、25μg/mL)诱导RAW264.7巨噬细胞发生增殖反应。与正常对照组相比，浓度为5、15、20μg/mL的LPS对RAW264.7巨噬细胞增殖作用较为明显(P＜0.05)；浓度为10μg/mL的LPS对RAW264.7巨噬细胞增殖作用显著明显(P＜0.01)。2.在白及胶/微米三七粉含药血清干预LPS诱导的炎症模型24h后，浓度为100、150、200、300μL/mL的白及胶/微米三七粉含药血清抑制LPS诱导的炎症模型的增殖作用较为明显(P＜0.05)。浓度为250μL/mL的白及胶/微米三七粉含药血清抑制LPS诱导的炎症模型的增殖作用显著明显(P＜0.01)。第二部分：白及胶/微米三七粉抑制LPS诱导RAW264.7巨噬细胞分泌炎性因子。检测白及胶/微米三七粉对LPS诱导RAW264.7巨噬细胞分泌的炎性因子IL-1β与iNOS的作用。与正常对照组相比，LPS显著地诱导RAW264.7巨噬细胞分泌IL-1β、iNOS炎性细胞因子(P＜0.01)。较LPS组相比，白及胶/微米三七粉可明显抑制炎性因子IL-1β、iNOS的分泌(P＜0.01)。第三部分：白及胶/微米三七粉抑制LPS诱导RAW264.7巨噬细胞产生炎性反应的机制。白及胶/微米三七粉对细胞胞浆NF-κBp65、p-IκBα蛋白表达和细胞胞核NF-κBp65蛋白表达的影响。较空白对照组相比，LPS组巨噬细胞胞浆NF-κBp65蛋白表达量明显降低(P＜0.01)，与LPS组相比，LPS+含药血清组巨噬细胞胞浆NF-κBp65蛋白表达量明显升高(P＜0.01)；较空白对照组相比，LPS组巨噬细胞胞核NF-κBp65蛋白表达量明显升高(P＜0.01)，与LPS组相比，LPS+含药血清组巨噬细胞胞核NF-κBp65蛋白表达量明显降低(P＜0.01)；说明白及胶/微米三七粉可明显抑制LPS诱导的NF-κBp65核转移。较空白对照组相比，LPS组细胞胞浆p-IκBα蛋白表达量明显增加(P＜0.01)，较LPS组相比，LPS+含药血清组巨噬细胞胞浆p-IκBα蛋白表达量明显降低(P＜0.01)，说明白及胶/微米三七粉可明显抑制LPS诱导的p-IκBα蛋白的表达。
结论：1.白及胶/微米三七粉可以有效降低细胞炎症模型中炎性因子的表达，减轻局部炎症反应，改善炎症微环境。2.白及胶/微米三七粉可以抑制NF-κB信号通路中NF-κBp65蛋白进入细胞核和IκBα蛋白的磷酸化，从而抑制巨噬细胞分泌炎性因子。