水稻AIP的RNA干扰和原核表达研究

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细胞骨架在植物生长发育中发挥了十分重要的作用。其中,微丝骨架结合蛋白在微丝骨架动态变化的过程中起着关键的调控作用,它们的调控保证了细胞分裂、细胞生长以及植物发育和形态建成的正常进行。本研究为了证明OsAIP的重要功能,一方面构建RNAi载体转化水稻,得到遗传数据,从体内分析其重要功能;一方面进行蛋白质原核表达,摸索纯化条件纯化OsAIP,获得高纯度的蛋白质进行生化研究,从体外直接证明OsAIP的重要功能。TCK303载体中包含了UBi-1启动子、两组特异酶切位点和两组酶切位点间的内含子。应用此载体构建RNAi载体,设计一对引物扩增了一条800bp的目标片段,然后用两组酶切和两个连接反应完成整个构建,从而缩短了水稻转化前的载体准备时间。木研究比较了几种原核表达菌株表达OsAIP的效果,证明了Tuner菌株更有利于OsAIP的表达;同时研究了诱导温度对蛋白质表达的影响,发现较低的诱导温度有利于OsAIP的表达,16℃是OsAIP的最佳诱导时间。在摸索纯化条件时,研究发现用Glutathione-Sepherose纯化OsAIP,仍然有少量非特异性条带出现,进一步用Q-Sepherose纯化获得了高纯度的蛋白质,满足了生化试验的要求。同时,为了快速、高效地获得转基因水稻植株,加快水稻研究进程,我们参考了一种快速的水稻转化方法,并在种子培养时间、浸染时间等方面进行了改进,使其更有利于中花11和日本晴的转化,从而证明了该方法具有广泛的应用价值。通过该方法转化水稻,从种子消毒处理到获得T0代再生植株只需要40d左右。并且,转化效率在85%左右,再生效率达到60%左右。
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