人巨细胞病毒及其IE86蛋白对ARPE-19细胞周期影响的研究

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目的:研究人巨细胞病毒(human cytomegalovirus, HCMV)感染人视网膜色素上皮细胞ARPE-19后对其细胞周期的影响,研究这种影响与HCMV IE86基因的相关性,探讨HCMV感染导致巨细胞病毒性视网膜炎的发病机制。方法:用HCMV感染同步化于Go/G1期的ARPE-19细胞作为感染组,同时设未感染组为对照组。于感染后1d、2d、3d、4d和5d收获细胞,RT-PCR方法检测HCMVIE72、IE86 mRNA水平的表达,用免疫荧光法检测细胞核内HCMV IE蛋白的表达,Western blot法检测HCMV早期蛋白IE72、IE86和晚期蛋白pp65的表达。MTT法检测病毒感染1-6天后对细胞增殖的影响,流式细胞术检测感染组与未感染组细胞DNA含量的变化。Western blot法检测病毒感染后细胞Cyclin D1、CyclinE表达的变化。采用PCR方法从质粒pIEP86AD169扩增出IE86基因片段,构建真核表达质粒pEGFP-N3-IE86,脂质体介导瞬时转染ARPE-19细胞,RT-PCR、免疫荧光法分析IE86基因的表达。流式细胞术检测质粒转染组及未转染组细胞DNA含量的变化。结果:HCMV IE72的mRNA在病毒感染后第1天检测到开始表达,IE86的mRNA在感染后第3天检测到开始表达;HCMV IE72、IE86和pp65蛋白可分别在病毒感染ARPE-19细胞2天、3天和5天时开始表达。MTT检测显示病毒感染3-6天后OD值分别为(0.646-0.0558)、(0.664±0.0765)、(0.723±0.1474)和(0.803±0.1073),与对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。流式细胞术示感染组在感染后第3天、4天、5天细胞周期的S期细胞比率为(21.78%±2.65%),(26.65%±0.71%),(31.80%±3.97%),与对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。Cyclin D1在未感染细胞及病毒感染1-2天时高表达,自感染3天起表达量开始下降。Cyclin E在未感染细胞及病毒感染1天时呈低表达状态,自感染第2天起表达量开始上升。瞬时转染质粒pEGFP-N3-IE86后24小时可检测到IE86在]mRNA水平和蛋白水平的表达。质粒瞬时转染48小时后细胞周期中S期细胞比率为(20.74%±1.60%),与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:HCMV可感染ARPE-19细胞。HCMV可促同步化于Go/G1期的ARPE-19细胞进入S期,且停滞于S期。IE86蛋白可以引起同步化于Go/G1期的ARPE-19细胞进入S期,提示HCMV导致ARPE-19细胞周期的改变可能由HCMV的IE86蛋白引起。
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