咪喹莫特对人皮肤鳞状细胞癌SCL-1细胞株作用机制的研究前言皮肤鳞状细胞癌是起源于角质形成细胞或附属器鳞状上皮细胞的恶性肿瘤，是最常见的皮肤恶性肿瘤之一，其发病率约占全部非黑素性皮肤细胞癌的20％。随着Mohs′手术的应用和推广，绝大部分皮肤鳞癌的治疗可取得较好的效果，但对于某些不适于接受皮肤外科治疗，如非典型的皮肤癌前病变、损害发生于外阴等特殊部位、皮损数量较多面积较大者，或者术后需要预防复发的病例，选择适当有效的外用药物进行局部治疗便显得非常重要。咪喹莫特是一种非核苷类异环咪唑喹啉胺类药物，临床研究证实其外用制剂具有显著的抗皮肤肿瘤活性。美国FDA已批准将咪喹莫特用于日光性角化和基底细胞癌的治疗。有关咪喹莫特抗癌作用的具体机制仍不十分明了，一般认为，咪喹莫特主要是通过与免疫相关细胞表面的Toll样受体结合、促进IFN-α、TNF-α、IL-12等多种前炎症细胞因子的分泌，进而激活天然与获得性免疫反应的方式发挥抗癌作用；进一步的研究发现，咪喹莫特尚能选择性的抑制某些皮肤肿瘤细胞的增殖并诱导其凋亡，提示增殖抑制和诱导凋亡可能是评价咪喹莫特抗肿瘤作用的重要指标和机制。本实验以人皮肤鳞状细胞癌SCL-1细胞株为靶细胞，观察不同浓度的咪喹莫特对SCL-1细胞的增殖抑制作用和凋亡诱导作用，在掌握药物作用前后SCL-1细胞Fas、bcl-2、hTERT、C-Myc基因表达变化的基础上，分析咪喹莫特诱导皮肤鳞癌细胞凋亡和降低其端粒酶活性的机制以及两者间的联系，为临床应用咪喹莫特治疗皮肤鳞状细胞癌提供有价值的依据。实验材料与方法1、细胞培养SCL-1细胞使用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基在37℃、5％CO₂饱和湿度的孵箱中培养，每日观察细胞形态变化。2、MTT检测SCL-1细胞以1×10⁵／mL接种于96孔培养板中，实验组细胞培养液浓度为含25μg／mL、50μg／mL、75μg／mL、100μg／mL、125μg／mL、150μg／mL、175μg／mL、200μg／mL和225μg／mL咪喹莫特的培养液，对照组细胞为不含咪喹莫特的培养液，每孔加入MTT溶液（5μg／mL）试剂20μL，37℃孵育4h，中止培养，每孔加入DMSO 150μL，震荡10min，用酶联免疫检测仪570nM处测定每孔吸光度值（OD）。抑制率（％）=（1-处理组OD值／对照组OD值）×100％3、细胞形态学观察取分别含0μg／mL、150μg／mL咪喹莫特的培养液，培养SCL-1细胞48h后于倒置相差显微镜下观察细胞形态变化并照相。4、流式细胞仪测定细胞早期凋亡SCL-1细胞以1×10⁶个／孔接种于6孔培养板中，使用含0μg／mL、150μg／mL咪喹莫特的培养液培养12～48h，收集贴壁生长的细胞制成单细胞悬液，PBS洗两次，分别加入5μL Annexin V／FITC和10μL浓度20μg／mL的PI溶液，混匀后室温避光孵育15min，流式细胞仪检测，结果用Cell Quest软件分析。5、Cell Death Detection ELISA kit检测细胞凋亡率将SCL-1细胞以1×10⁶个／孔的密度接种于96孔板，用含50μg／mL、75μg／mL、100μg／mL、125μg／mL、150μg／mL咪喹莫特的培养液培养12h、24h和48h，至设定时间后将96孔板取出，离心（200×g，10min）并去孔内上清，每孔加入溶解缓冲液200μL，室温孵育30min，重复离心并吸取孔内底部样本20μL，加入涂敷有抗生物素蛋白链菌素的孔板中，孔板每孔加入含有抗-组蛋白-生物素、抗-DNA-POD和培养缓冲液的免疫反应剂80μL（组分构成比1：1：18），振荡（300 rpm）2h，倾尽残液，培养缓冲液300μL洗涤3次，沥干，每孔加入ABTS显色溶液100μL，250rpm轻摇15min，使显色充分，酶联免疫检测仪测定每孔490nM波长处的吸光度值。6、丫啶橙荧光染色观察细胞晚期凋亡取经0μg／mL、150μg／mL咪喹莫特作用48h的SCL-1细胞，PBS洗涤1次，取95μL细胞悬液（1×10⁷个／mL）加入5μL丫啶橙，混匀后吸1滴于洁净载玻片上，立即在490nM波长的荧光显微镜下观察。7、端粒酶活性检测用TRAP-PCR-ELISA法进行端粒酶活性检测，分别收集经浓度为0μg／mL、50μg／mL、75μg／mL、100μg／mL、125μg／mL、150μg／mL的咪喹莫特作用48h的SCL-1细胞，制备端粒酶提取液。RT-PCR扩增：引物延伸，取上述提取液6μg，加反应混合液，置25℃，30min。端粒酶的灭活，94℃，5min。PCR扩增，变性94℃，30s，退火50℃，30s，延伸72℃，90s，共30个循环。平衡，置72℃，10min。扩增产物的检测，取5μL扩增产物，加20μL变性试剂，室温10min。加入225μL杂交混合液（含地高辛标记的检测探针），充分混匀后，取100μL于抗生物素蛋白包被的微孔板上，37℃摇床杂交2h。加入过氧化物酶偶联的抗地高辛抗体，室温30min。TMB底物显色10min，加中止液中止反应，测定450nM处的吸光度，连续检测2次并取其均值。8、细胞免疫组化和免疫荧光0.25％胰酶消化后，收集经浓度为0μg／mL、15μg／mL的咪喹莫特作用48h的SCL-1细胞。PBS洗2次，细胞离心机1000rpm，5min，制做细胞甩片。丙酮4℃固定10min。0.3％H₂O₂溶液与标本室温反应30min，抑制内源性过氧化物酶的活性。加入一抗分别为鼠抗人Fas、bcl-2、c-Myc；羊抗人TERT单抗，4℃过夜。PBS洗后分别加入辣根过氧化酶和FITC标记的IgG二抗，37℃孵育2小时。DAB显色和荧光显微镜下观察。9、RT-PCR取经0μg／mL、50μg／mL、150μg／mL咪喹莫特作用48h的人皮肤鳞癌SCL-1细胞，检测相关基因Fas、bcl-2、hTERT、c-Myc mRNA水平的变化。实验结果1、咪喹莫特对SCL-1细胞抑制作用人皮肤鳞状细胞癌SCL-1细胞对咪喹莫特敏感，随着咪喹莫特药物浓度的升高，细胞存活率降低，呈剂量依赖性。从细胞增殖抑制曲线中得出IC30和IC50值的咪喹莫特浓度分别为47μg／mL和152μg／mL。2、细胞形态学观察150μg／mL咪喹莫特作用48h后SCL-1细胞体积缩小，胞膜皱缩，形态不规则，大多数细胞脱壁漂浮。细胞形态改变随咪喹莫特作用浓度增高，作用时间延长而更趋明显。3、流式细胞仪测定细胞早期凋亡150μg／mL咪喹莫特处理24h后，SCL-1细胞的早期凋亡现象最为明显，Cell Quest软件分析其24h细胞早期凋亡率为47.23％。4、Cell Death Detection ELISA kit检测细胞凋亡率ELISA实验结果显示，SCL-1细胞凋亡程度随咪喹莫特作用浓度增高、作用时间延长而逐渐升高，呈现明显的量效和时效依赖性关系。细胞凋亡程度在不同药物处理浓度和作用时间组间存在显著性差异，即药物浓度组间：F=15.96，P＜0.01；时间组间：F=15.78，＜0.01。5、丫啶橙荧光染色观察细胞晚期凋亡荧光显微镜下观察，对照组SCL-1细胞胞核呈黄绿色，核浆比例较大，胞浆为橙红色；150μg／mL咪喹莫特作用48h后，细胞形态明显不规则，胞核染色质呈黄绿色浓聚于核膜内侧，核固缩、碎裂，细胞膜呈泡状膨出，内可见凋亡小体。6、端粒酶活性测定TRAP-PCR-ELISA检测发现，SCL-1细胞端粒酶活性随咪喹莫特作用浓度的增高而逐渐降低，呈现明显的量效依赖性关系，不同浓度的咪喹莫特处理组间，SCL-1细胞端粒酶活性存在显著的统计学差异F=615.90，P＜0.01。7、细胞免疫组化和免疫荧光细胞免疫组化染色显示，经150μg／mL的咪喹莫特作用48h，Fas蛋白表达水平上升；bcl-2和c-Myc蛋白表达下降；细胞免疫荧光显示，TERT蛋白表达下降。8、RT-PCR随着咪喹莫特作用浓度的增高，药物处理48h后皮肤鳞癌SCL-1细胞中相关基因bcl-2、c-Myc、hTERT的mRNA表达水平逐渐降低，Fas表达逐渐升高，差异均有显著性P＜0.01。结论1、咪喹莫特可抑制体外培养的人皮肤鳞状细胞癌SCL-1细胞株增殖并诱导其凋亡，且在一定范围内呈时间浓度依赖性。2、咪喹莫特可使体外培养的人皮肤鳞状细胞癌SCL-1细胞株bcl-2 mRNA及蛋白的表达水平下调，Fas mRNA及蛋白的表达水平上调，并在一定范围内呈浓度依赖性。3、咪喹莫特可使体外培养的人皮肤鳞状细胞癌SCL-1细胞株hTERT mRNA及蛋白的表达水平下调，且SCL-1细胞凋亡程度与hTERT表达呈显著负相关。4、咪喹莫特可降低体外培养的人皮肤鳞状细胞癌SCL-1细胞株端粒酶活性，并具有浓度依赖性。5、咪喹莫特可使体外培养的人皮肤鳞状细胞癌SCL-1细胞株c-Myc mRNA及蛋白的表达水平降低，并在一定范围内呈浓度依赖性。