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α-酮异戊酸(α-ketoisovalerate)是多个生物合成和化学合成领域中重要的中间体,在医药和化学合成领域具有广泛的研究和应用。与传统的化学合成方法相比,生物转化具有高效、高特异性和对环境友好的优点,在将来工业化α-酮酸的生产中更具有潜力。全细胞转化法利于产物分离,也可维持细胞膜酶的稳定性,是将来重要的生物转化催化剂。本研究以大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)为宿主菌,选择了Proteus myxofaciens为来源的L-氨基酸脱氨酶(L-amino acid deaminase)构建表达载体,并对L-氨基酸脱氨酶进行分子模拟,通过分子改造理性设计L-氨基酸脱氨酶,提高了全细胞转化L-缬氨酸(LVal)生产KIV的产量。论文主要研究内容如下:(1)成功构建了重组大肠杆菌E.coli BL21(ladf),其含有来自Proteus myxofaciens的L-氨基酸脱氨酶基因。敲除细胞膜上支链氨基酸转运蛋白基因livF和氨基酸转氨酶基因ilvE,以提高底物L-缬氨酸的利用率。(2)在摇瓶上对重组大肠杆菌E.coli BL21(△livF△ilvE,ladf)进行全细胞转化的反应条件优化。优化后确定实验室内最佳全细胞转化反应条件为:32℃,pH6.5,100 mmol·L-1底物L-缬氨酸,10 g·L-1 DCW细胞,以25 mL反应体系在250 m L三角瓶内进行12 h。(3)在进行定点突变分子改造前,菌体终浓度能达到4.50 g·L-1左右。通过蛋白质改造、诱导剂浓度优化和阶段控温策略,实现了重组L-氨基酸脱氨酶的高效表达,(4)为得到完整的L-氨基酸脱氨酶蛋白结构,基于序列比对结果,采用同源建模构建了来源于Proteus myxofaciens的L-氨基酸脱氨酶蛋白结构,并利用AutoDock4.0软件将L-缬氨酸与L-氨基酸脱氨酶进行柔性分子对接,得到了关键的活性位点PHE318,ARG316,ASN100和GLN276。根据分子对接结果,选择了其中4个位点(N100、Q276、R316和F318)进行定点饱和突变,其中F318T表现出最高催化效率(4.439 g·L-1,转化率为39.3%,转化效率为53.27 mg·L-1·h-1·g-1 DCW)。在F318T的基础上,为进一步提高L-氨基酸脱氨酶转化效率,对N100进行饱和突变,N100H表现出最高转化效率,在F318T和N100H的复合突变体上进行位点Q276的饱和突变,复合突变体(F318T,N100H和Q276E)的产量为8.197 g·L-1。