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猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道疾病为特征的病毒性疾病。本研究通过分析PRRSV感染后肺泡巨噬细胞(PAM)的模式识别受体、干扰素激活相关基因及细胞因子的mRNA转录动态,从天然免疫的角度系统分析了PRRSV感染对PAM免疫功能的影响。 用RT-PCR技术从PAM中扩增和克隆了猪模式识别受体(PRR)CD16、CD18、TLR2、TLR4和SR,天然免疫功能相关分子Nramp1、SP-A,干扰素激活相关基因(ISG)OAS、PKR、Mx1,以及猪细胞因子IFN-α和IL-6基因,经测序鉴定后,利用反向PCR技术构建了相应的缺失cDNA竞争分子。通过竞争PCR方法,建立了各种分子的标准竞争曲线和直线回归方程。 用竞争定量RT-PCR技术检测PRRSV感染后PAM模式识别受体CD16、CD18、SR、TLR2、TLR4和天然免疫功能相关分子SP-A、Nramp1 mRNA的转录动态。体外感染试验结果显示,PAM的PRR和SP-A、Nramp1的mRNA均在感染后4h急剧下降到最低转录水平,随后逐渐升高,到感染后48h全部恢复正常,表明各功能分子在PRRSV感染早期mRNA的转录受到抑制,造成PAM天然免疫功能下降。体内感染试验结果表明,在PRRSV感染前期(3～14天),肺泡巨噬细胞PRR和SP-A、Nramp1 mRNA转录受到不同程度的抑制,说明PRRSV感染早期可导致PAM天然免疫功能下降;在感染后期(28～42天),各功能分子的mRNA转录水平恢复正常或表达上调,提示PAM天然免疫功能有所恢复并提高。 采用竞争定量RT-PCR检测PRRSV感染后PAM的干扰素激活相关基因OAS、PKR、Mx1的mRNA转录动态。体外感染试验结果显示,OAS、PKR、Mx1 mRNA转录水平始终低于对照组,表明在PRRSV感染过程中干扰素激活相关基因的转录始终受到抑制,导致PAM的抗病毒能力降低;体内感染试验结果显示,ISG在接种后3～7天没有明显变化,在接种后14天mRNA转录水平迅速下降到最低点,表明PRRSV感染后2周ISG基因转录受到严重抑制,导致PAM抗病毒功能下降;到接种后28～42天,ISG恢复正常并略有升高。 利用竞争定量RT-PCR检测PRRSV感染后PAM中细胞因子IFN-α、IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-8、MCP-1、IL-10、IL-12p40、IL-18、GM-CSF及IEN-γ的mRNA转录动态,同时,采用定量ELISA检测PAM培养上清中IFN-α、IL-6、IL-10和IL-12的蛋白浓度。体外试验结果表明,在感染早期促炎性细胞因子表达上调,各细胞因子的上调幅度和形成转录高峰时间有所不同,表明PRRSV体外感染可引起PAM的炎症反应。体内试验结果表明,在感染早期(3～7天),促炎性细胞因子IFN-α、IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-8等mRNA转录有不同程度的下降;在感染中期(14天),IL-10的mRNA转录持续升高,而Th1型细胞因子IL-12、IL-18和GM-CSF转录下调,表明PRRSV感染后PAM的免疫调节功能受损,引起免疫抑制;在感染后期(28～42天),IFN-α、IL-6、IL-12、IL-18和IFN-γ等转录升高,表明PAM免疫调节功能有所恢复。对PAM培养上清中IFN-α、IL-6、IL-10和IL-12的蛋白检测结果表明这些因子的蛋白表达变化与mRNA转录动态基本一致。