结直肠癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，其发病率呈逐年上升趋势，且疗效仍不乐观，近25年结直肠癌的5年生存率徘徊在50～60％左右。导入抑癌基因是肿瘤基因治疗的重要策略，筛选并发现新的抑癌基因可为肿瘤治疗提供新的切入点。　　 细丝蛋白A(filaminA，FLNa)是非肌性肌动蛋白结合蛋白，其基因结构高度保守，表达广泛，对哺乳动物的生长发育具有重要的作用。FLNa是主要分布在细胞质的大分子蛋白质，最初的研究表明其通过绑束纤维状肌动蛋白，形成动态、立体的的细胞骨架。但最新的临床及实验研究发现FLNa蛋白类似棒状的结构域中的多重片层结构，提供了蛋白质相互作用的界面，是细胞信号转导通路中重要的支架蛋白，多种具有重要功能的蛋白质能与之相互作用。在这些蛋白中许多是膜受体，与细胞的增殖、黏附、迁徙等行为有关。FLNa还参与了肿瘤形成有关的信号转导通路，与肿瘤的发生和发展具有密切关系。　　 本研究第一部分采用免疫组织化学法、RT-PCR和Western bolt法检测FLNa在60例结直肠腺癌患者癌组织及结直肠正常组织标本中的表达情况，并结合临床资料进行分析，探讨FLNa的表达水平与结直肠腺癌的发生发展的相关性。在第二部分实验中，将含FLNa cDNA的质粒载体pcDNA3.1/V5-His-TOPO/FLNa以脂质体介导方式转染SW480细胞。经G418筛选，获得FLNa基因稳定表达的SW480/FLNa细胞。RT-PCR和Western blot技术检测FLNa基因的导入情况；MTT法检测SW48细胞的增殖能力；划痕损伤实验、Transwell小室和Matrigel侵袭模型观察SW480细胞侵袭和转移能力的变化，评价FLNa对人结肠癌SW480细胞体外侵袭转移行为的影响。并将细脆接种于裸鼠的皮下，观察其瘤体生长情况；8周后剥除瘤体、称重、计算抑瘤率；观察瘤组织的形态学变化，研究FLNa对SW480细胞在裸鼠体内成瘤的影响。在第三部分实验中，以人结肠癌细胞SW480及SW480/FLNa细胞作为研究对象，观察经EGF和U0126处理后，细胞内FLNa、胞质ERK、细胞核内磷酸化ERK和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)蛋白表达水平的变化，研究FLNa在ERK信号通路对SW480细胞体外侵袭能力的影响。　　 第一部分 FLNa在结直肠腺癌组织中表达及临床意义　　 目的：观察FLNa在结直肠腺癌患者癌组织和正常结直肠组织中的表达情况，探讨FLNa的表达水平与结直肠腺癌的发生发展的相关性。　　 方法：　　 1 标本采集：收集河北医科大学第四医院外二科2009年1月-9月60例行手术切除取得的结直肠腺癌组织及结直肠正常组织。腺癌组织切取于肿瘤中心部位（非坏死组织区），而正常结直肠组织的切取部位距肿瘤边缘大于10cm处。病理诊断确诊所有病例，且无其他部位原发肿瘤，均无化疗、放疗和免疫治疗史。标本取材后，部分置于液氮中速冻，然后转到-80℃冰箱内保存；部分标本用10％甲醛固定，石蜡包埋，作免疫组化染色。　　 2 免疫组化检测FLNa在结直肠腺癌及正常结直肠组织中的表达。　　 3 结合临床资料进行分析。　　 4 RT-PCR检测FLNa mRNA在结直肠腺癌及正常结直肠组织中的表达水平。　　 5 Western blot检测FLNa蛋白在结直肠腺癌及正常结直肠组织中的表达水平。　　 结果：　　 1 FLNa的阳性表达定位于细胞质。在结直肠腺癌组织的阳性表达率为50.0％(30/60)，其中强阳性表达率为11.7％(7/60)，弱阳性表达率为38.3％(23/60)，而在正常结直肠组织的阳性表达率为91.7％(55/60)(P=0.000＜0.05)。　　 2 FLNa的表达水平与结直肠腺癌组织的TNM分期、肝转移、淋巴结转移和肠壁浸润深度具有相关性，而与患者性别、年龄、肿瘤部位、大小、分化程度、肉眼观形态和组织学类型无关。　　 3 结直肠腺癌组织中FLNa mRNA的表达水平较正常组织低[(0.24±0.03) vs(0.95±0.04), P=0.017＜0.05]。　　 4 结直肠腺癌组织中FLNa蛋白表达水平较正常组织低[(0.15±0.02)vs(0.76±0.04),P=0.013＜0.05]。　　 结论：　　 1 FLNa的低表达与结直肠腺癌的形成具有相关性。　　 2 FLNa的低表达水平与肿瘤的较晚的TNM分期、肝转移、淋巴结转移和肠壁较深的浸润深度具有相关性。第二部分FLNa对人结肠癌SW480细胞侵袭行为的影响。　　 目的：通过将含FLNa cDNA的质粒转染人结肠癌SW480细胞，过表达细胞内的FLNa基因，研究FLNa对人结肠癌SW480细胞侵袭转移行为的影响。　　 方法：　　 1 将FLNa基因质粒载体pcDNA3.1/V5-His-TOPO/FLNa，以脂质体介导方式转染SW480细胞。经G418筛选，获得FLNa基因稳定表达的SW480/FLNa细胞。　　 2 RT-PCR和Western blot技术检测FLNa基因的导入情况。　　 3 MTT法检测细胞体外的增殖能力。　　 4 划痕损伤实验检测细胞的迁移能力。　　 5 Transwell小室和Matrigel侵袭模型评价FLNa对细胞侵袭能力的影响。　　 6 将SW480/FLNa、SW480/pcDNA3.1和SW480细胞接种于裸鼠的皮下，观察其瘤体生长情况。　　 7 8周后进行肿瘤重量分析并计算抑瘤率。　　 8 观察瘤组织的形态学变化。　　 结果：　　 1 FLNa的表达载体pcDNA3.1/V5-His-TOPO/FLNa在SW480细胞中获得稳定表达。　　 2 MTT检测结果表明，三组SW480细胞在体外的生长曲线基本重叠，增殖能力无差异。　　 3划痕损伤实验结果表明，SW480/FLNa组细胞缓慢向中央迁移，缺损处修复缓慢，SW480组向划痕处的迁移速度明显快于SW480/FLNa组。　　 4 Transwell小室迁移实验和Matrigel侵袭实验表明，SW480/FLNa组较SW480组穿膜/胶数量明显减少。　　 5 SW480/FLNa组细胞在裸鼠体内的瘤体的生长速度低于SW480组。　　 6 SW480/FLNa组细胞在裸鼠体内的瘤体重量低于SW480组。　　 7 SW480/FLNa组细胞在裸鼠体内的瘤体组织出现明显退变坏死。　　 结论：FLNa能够抑制SW480细胞体外的侵袭能力，并对在裸鼠体内的成瘤具有抑制作用。　　 第三部分FLNa通过ERK信号通路抑制SW480细胞体外侵袭　　 目的：研究FLNa在ERK信号通路对SW480细胞体外侵袭能力的影响，初步探讨FLNa抑癌作用的机制。　　 方法：　　 1 采用Western blot法检测ERK抑制剂U0126对SW480细胞质内ERK表达水平的影响。　　 2 采用Western blot法检测ERK激活剂EGF对SW480/FLNa细胞质内ERK表达水平的影响。　　 3 以SW480细胞为对照组，采用Western blot法检测经U0126处理20分钟后的SW480细胞和SW480/FLNa细胞的胞质ERK、胞核p-ERK、胞质MMP-9蛋白表达水平。　　 4 以SW480/FLNa细胞为对照组，采用Western blot法检测经EGF处理20分钟后的SW480/FLNa细胞和SW480细胞的胞质ERK、胞核内p-ERK、胞质MMP-9蛋白表达水平。　　 5 以SW480细胞为对照组，观察经U0126处理20分钟后SW480细胞和SW480/FLNa细胞的体外侵袭能力的改变。　　 6 以SW480/FLNa为对照组，观察经EGF处理20分钟后的SW480/FLNa细胞和SW480细胞在体外侵袭能力的改变。　　 结果：　　 1 经U0126处理5、10、20和30分钟后，SW480细胞质内ERK表达水平分别为0.936±0.030、0.826±0.029、0.130±0.007和0.124±0.001（F=1974.55,P=0.000）。经U0126处理20和30分钟后细胞质内ERK表达水平差异无统计学意义。经U0126处理20分钟后，可对SW480细胞质内ERK表达水平达到最大抑制效果。　　 2 经EGF处理5、10、20和30分钟后，SW480/FLNa细胞质内ERK表达水平分别为0.154±0.018、0.140±0.026、0.832±0.039和0.796±0.034（F=796.488,P=0.000）。经EGF处理20和30分钟后细胞质内ERK表达水平差异无统计学意义。经EGF处理20分钟后，可对SW480/FLNa细胞质内ERK表达水平达到最大激活效果。　　 3 SW480细胞、经U0126处理20分钟后SW480细胞和SW480/FLNa细胞胞质ERK表达水平分别为：0.500±0.016、0.082±0.013和0.090±0.016(F=1279.433,P=0.000);细胞核p-ERK表达水平分别为：0.439±0.014、0.003±0.001和0.010±0.002(F=5025.294,P=0.000);细胞质MMP-9蛋白表达水平分别为：0.450±0.036、0.004±0.002和0.004±0.001(F=766.091，P=0.000)。　　 4 SW480/FLNa细胞、经EGF处理20分钟后SW480/FLNa细胞和SW480细胞胞质内ERK表达水平分别为：0.071±0.006、0.758±0.075和0.808±0.058(F=279.252,P=0.000);胞核内磷酸化ERK表达水平分别为：0.021±0.002、0.260±0.004和0.269±0.010(F=2325.506，P=0.000)；胞质内MMP-9表达水平分别为：0.012±0.005、0.615±0.036和0.594±0.018(F=1086.979,P=0.000)。　　 5 SW480细胞、经U0126处理20分钟后SW480细胞和SW480/FLNa细胞的穿膜细胞数分别为214±5、81±2和77±3（F=1340.740,P=0.000），经U0126处理20分钟后SW480组低于SW480组(P=0.000)，SW480/FLNa组低于SW480组(P=0.000)。　　 6 SW480/FLNa细胞、经EGF处理20分钟后SW480/FLNa细胞和SW480细胞的穿膜细胞数分别为54±3、126±2和129±3(F=731.379，P=0.000)，经EGF处理20分钟后SW480/FLNa组高于SW480/FLNa组(P=0.000)，SW480组高于SW480/FLNa组(P=0.000)。　　 结论：FLNa抑制结肠癌SW480细胞侵袭转移能力的机制是通过抑制ERK信号通路，减少MMP-9蛋白的合成，降低肿瘤细胞对基底膜的降解，最终阻遏癌细胞的侵袭。