胆管癌是起源于胆管上皮的恶性肿瘤,在胃肠道恶性肿瘤中其发病率占到3%左右,但在肝胆系统中,却占到恶性肿瘤的大约30%,仅次于肝癌位居第二。流行病学资料显示,胆管癌的发病率和死亡率在世界范围内呈现升高的趋势。胆管癌起病隐匿,预后差,对化疗不敏感,手术根治性切除仅在早期患者中有显著疗效。但大多数的患者在诊断时已是晚期,只有小部分患者能从手术中受益。早期发现、早期治疗是改善胆管癌预后的有效途径,但目仍然缺乏有效的能够早期检测,指导临床治疗或判别预后的有效生物学指标,所以对胆管癌进行深入的科学研究,发现潜在的有临床价值的生物学指标具有重要的理论和实践意义。表皮生长因子受体(Epidermal growth factor, EGFR)家族由EGFR(ERBB1, HER1), HER2(ERBB2, Neu), HER3(ERBB3)和HER4(ERBB4)四种酪氨酸激酶受体组成。EGFR家族成员参与人体内许多重要的生命活动过程,如细胞的增殖、损伤的修复等；同时EGFR家族在机体炎症、肿瘤等诸多病理过程中也发挥着重要的作用。EGFR家族成员和相应的配体结合后激活,形成同型二聚体或异型二聚体,引起自身磷酸化进一步激活下游信号通路,从而调控细胞的增殖、分化和迁移等生理或病理活动。EGFR家族在肿瘤中的作用受到越来越多的重视,在大多数的研究中,研究者往往关注于EGFR家族的某一个或者几个成员。这可能会造成一定的片面性,因为一方面,在不同类别的肿瘤中,EGFR家族成员表达方式各异,即使相同类型的肿瘤间也存在患者方面的个体差异；另一方面,肿瘤中EGFR家族成员不同的表达方式意味着成员间会有不同二聚体结合方式,仅关注其中个别成员的表达情况,忽略了成员间的相互作用,可能会影响结论的客观性。所以,研究EGFR家族在肿瘤中的总体效应,应当将EGFR家族所有成员作为一个整体进行系统的探讨。在胆管癌中,研究者已对EGFR家族成员中EGFR和HER2的作用进行了较为详细的研究,并取得一些共识。研究表明,在胆管癌中EGFR是指示预后有效生物学指标,以EGFR为靶向的酪氨酸酶受体抑制剂已经进入了临床试验阶段。家族的另外一个成员,HER2在胆管癌中具有相对较低的表达率。不同于乳腺癌、胃癌和肺癌,以EGFR和HER2为靶标的靶向治疗并未取得较满意的临床效果。而目前关于HER3和HER4在胆管癌中表达及临床病理联系的报道较少,尤其缺乏HER4与胆管癌临床病理联系及相关生物学功能的报道,所以其他成员与EGFR和HER2之间的相互影响值得研究。在胆管癌中,EGFR家族成员的激活不是孤立的事件。各种因素导致的持续的慢性炎症是胆管癌发生的危险因素,炎症因子、生长因子,趋化因子形成一个有利于胆管癌细胞发生和发展的复杂的微环境。其中既有EGFR家族成员与其特异性配体的结合后的激活,也存在与其他不同因子或其通路蛋白间的交叉作用引起的激活。神经生长因子(Nerve growth factor, NGF)属于神经营养因子家族成员,NGF既可以作为一种生长因子,参与神经细胞生长发育的调控,也可以作为炎性介质参与介导炎症反应；研究表明在胆管中NGF的过表达可以促进肿瘤的侵袭和浸润；在前列腺癌中NGF结合其受体TrkA后激活的细胞通路和EGFR家族成员HER2信号通路之间存在"Crosstalk",TrkA受体抑制可以与针对HER2的靶向治疗药物起到协同作用。基于NGF的以上特性和胆管癌中存在EGFR过表达情况,我们进一步探讨了胆管癌中EGFR和NGF/TrkA的相互关系。我们首先构建了胆管癌标本微阵列组织芯片,采用免疫组织化学和荧光原位杂交技术,研究了胆管癌中EGFR家族成员的表达及其与临床病理特征之间的联系。在体外实验中我们构建了HER4过表达质粒和HER4siRNA片段,在胆管癌细胞株进行HER4基因的过表达和沉默,观察其对胆管癌细胞细胞功能的影响并对其机制进行了初步的探讨。同时我们在受体水平和通路蛋白水平对胆管癌中EGFR和NGF/TrkA通路之间的关系进行了初步的研究。在本文的最后一节,我们采用免疫组织化学技术检测了胆管中NGF和TrkA的表达,研究NGF和胆管癌临床病理特征之间的联系,对影响预后的机制进行了初步探讨。第一部分胆管癌中EGFR家族成员的表达及临床病理特征的研究目的：系统检测EGFR家族各成员在胆管癌中的表达,探讨EGFR家族成员和临床病理特征的联系以及与胆管癌患者预后的关系。方法：1.建立胆管癌患者数据库,构建胆管癌肿瘤组织高通量芯片。选取齐鲁医院2004年3月-2008年10月胆管癌病例175例,采集患者性别、.年龄、临床分期、肿瘤大小、淋巴结转移、手术方式、结实、肝炎感染等临床信息,构建胆管癌患者数据库,并随访患者。选择相应患者病理组织标本,构建胆管癌高通量组织微阵列。2.应用免疫组织化学方法检测EGFR各成员在胆管癌中的表达,分析其与临床病理特征的关系。在微阵列组织芯片中应用EGFR、HER2、HER3和HER4单克隆抗体,检测EGFR家族成员的表达情况,分析各成员表达的内在联系及与临床病理特征的关系。3.EGFR家族成员在胆管癌中预后意义的分析采用Kaplan-Meier(K-M)法和COX回归对EGFR家族成员的表达与胆管癌患者预后的关系进行单因素和多因素分析。4.应用荧光原位杂交检测胆管癌组织中EGFR和ERBB2的表达。应用GLP EGFR/CSP7和GLP HER2/CSP17探针检测组织微阵列芯片中EGFR和HER2的基因扩增情况。结果：1.构建了胆管癌患者临床资料信息库成功构建了175例胆管癌患者信息资料库,并对其中143例进行了成功随访；以病理标本为基础制作了胆管癌肿瘤组织高通量组织芯片。2.EGFR家族成员在胆管癌中的表达和临床病理联系EGFR, HER3和HER4在肝内胆管癌中的表达率分别为：30.8%(20/65)、12.3%、(8/65)63.1%和(41/65),HER2在肝内未见有表达；EGFR, HER2、 HER3和HER4在肝外的表达率分别为20.9%(23/110)、11.5%(13/110)、4.5%(5/110)和56.4%(62/110)。在肝内胆管癌中,EGFR和HER3在低分化的肿瘤中高表达而在中等及高分化胆管癌低表达且差别有意义(P=0.033; P=0.047); HER4在临床分期低的肿瘤中高表达,且在不同临床分期患者间差异具有显著性(P=0.046)。在肝外胆管癌中,发生淋巴结转移的胆管癌患者中存在EGFR的高表达,与淋巴结转移阴性的患者间存在显著性差异(P=0.009); HER2仅表达与高分化肿瘤中,且在不同临床分期间差别具有显著性(P=0.050)。荧光原位杂交结果显示,EGFR在肝内胆管癌中的扩增率1.6%(1/63),在肝外胆管癌中为2.8%(3/106)；EGFR的扩增和过表达具有相关性(P=0.002); HER2在肝内胆管癌中未见有扩增,在肝外胆管癌中的扩增率为7.4%(8/108)且与HER2的表达具有相关性(P<0.001)。3.胆管癌患者的生存分析肝内胆管癌中,单因素分析显示：组织分化(P=0.004)、肿瘤直径(P=0.012)、肿瘤T分期(P=0.003)、淋巴结转移(P<0.001)和EGFR的表达(P=0.016)具有统计学意义；多因素分析：EGFR的表达(HR (95%CI):3.689(1.253-10.587), P=0.018)和淋巴结转移是胆管癌不良预后的独立预后因素。肝外胆管癌中,肿瘤组织分化(P<0.001)、临床T分期(P=0.006)、淋巴结转移(P<0.001)和EGFR过表达(P=0.026)在单因素分析中具有统计学意义；多因素分析仅淋巴结转移一项为具有独立预后意义的因素(HR (95%CI):4.248(1.761-10.249), P=0.001)。生存分析结果显示,HER4在肝内和肝外胆管癌中均未见其对预后的显著影响,虽然在肝内胆管癌中HER4阳性的患者生存率高于HER4阴性的患者,但未达到统计学显著性；但进一步的数据分析显示：在肝内胆管癌EGFR阴性的亚组中,表达HER4的患者预后良好(P=0.023)。结论：本部分中我们检测了EGFR家族成员在肝内和肝外胆管癌中的表达,采用FISH的方法研究了EGFR和HER2在胆管癌中的扩增情况。实验结果证实了EGFR在肝内胆管中表达的意义,同时第一次表明：在肝内胆管癌中EGFR表达阴性的患者中,HER4阳性的患者较HER4阴性的患者预后良好。第二部分HER4对胆管癌细胞功能的影响和机制研究目的：本部分中研究了HER4对胆管癌细胞株增殖、迁移和浸润能力等的影响,并探讨HER4发挥其影响作用的可能机制。方法：1.构建HER4过表达质粒,合成HER4的siRNA干扰片段采用PCR方法,分段克隆并连接,克隆了人HER4的基因cDNA片段,将该片段经酶切,插入GV135载体中,经测序,成功构建了人表达载体GV135-HER4。该载体送吉凯生物公司进行腺病毒包装。HER4的siRNA干扰片段由上海凯基公司合成。2.胆管癌细胞株增殖、迁移和浸润能力的检测培养肝内胆管癌RBE细胞株并分组：MOCK (Lipofectamine)组,NC(Lipofectamine+Scramble siRNA)组和siRNA-HER4(Lipofectamine+siRNA-HER4)组。培养RBE细胞,接种于96孔板中分别于Oh、24h、48h、72h时间点用MTS法检测各组细胞增殖率。培养HUCC-1细胞,检测不同时间点空载体组和GV135-HER4组的增殖率。接种RBE细胞于12孔板中,均匀划痕,分别于6h、24h和48h观察不同处理组间划痕间距的变化。用siRNA-HER4处理RBE细胞,用GV135-HER4处理HUCCT-1,取24h后的RBE和HUCCT-1转移至Transwell小室中培养6h,分别计数并比较HER4干扰和过表达后与各自相应对照组穿过基底膜的RBE和HUCCT-1细胞数目。3.HER4对胆管癌细胞凋亡的影响的检测培养RBE细胞并分为MOCK, NC和siRNA-HER4组；培养HUCCT-1细胞,分为空载体组和GV135-HER4组,用活性分光光度法检测试剂盒检测Caspase-8,-9,-3活性变化。结果：1.重组质粒经过双酶切和测序鉴定,结果显示与目的基因序列完全一致。2.HER4过表达降低胆管癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力,抑制HER4的表达则出现相反变化。MTS结果显示：siRNA-HER4组RBE细胞增殖能力较Mock和NC组强,且差距有统计学意义(P<0.05)。而GV135-HER4组HUCCT-1细胞增殖能力较空载体组增殖能力下降(P<0.05)。划痕实验结果显示siRNA-HER4组划痕较Mock和NC组愈合明显；Transwell结果显示siRNA-HER4组穿过小室的细胞数目多于Mock和NC组(P<0.05)；而GV135-HER4组穿过小室基底膜细胞数量较空载体组少(P<0.05)。3.HER4过表达促进了胆管癌细胞的凋亡。活性分光光度法检测结果显示：siRNA-HER4组Caspase-9,-3活性较对照组降低,但Caspase-8变化不明显；而GV135-HER4组Caspase-9,-3活性较对照组升高,而Caspase-8变化不明显。结论：在胆管癌中干扰HER4的表达增加了胆管癌细胞增殖、迁移和侵袭能力；HER4过表达后,降低了胆管癌细胞增殖和侵袭能力。凋亡检测结果表明：HER4的过表达促进细胞凋亡。HER4在胆管癌中起到“保护”作用的可能机制与HER4促进胆管癌细胞凋亡的发生有一定关联。第三部分胆管癌中EGF和NGF对细胞信号通路调控及相互影响目的：观察EGF和NGF所激活的胆管癌细胞株细胞受体磷酸化水平和信号通路蛋白的变化,探讨二者联系的可能机制。方法：1.EGF对TrkA蛋白磷酸化影响的检测选择重组EGF引起TrkA磷酸化的合适的浓度和时间点。用抗EGFR抗体AG1478、TrkA抑制剂K252a、ERK蛋白抑制剂PD98059和NGF单克隆抗体预处理RBE细胞,免疫印迹法检测加入EGF后TrkA蛋白磷酸化水平的变化；用ELISA法检并比较测培养基中NGF蛋白水平。2. TrkA对EGF蛋白磷酸化影响的检测选择重组NGF引起EGFR磷酸化的合适的浓度和时间点。用抗EGFR抗体AG1478、TrkA抑制剂K252a、ERK蛋白抑制剂PD98059和NGF单克隆抗体预处理RBE细胞,免疫印迹法检测加入NGF后EGFR蛋白磷酸化水平的变化；用ELISA法检测并比较培养基中NGF蛋白水平。结果：EGF可以引起TrkA磷酸化水平的升高；K252a、NGF单克隆抗体降低以上趋势；NGF诱导EGFR磷酸化水平的升高；K252a、AG1478降低了NGF引起的EGFR磷酸化水平的升高。ELISA结果显示重组人EGF蛋白可以刺激RBE细胞NGF的分泌；重组NGF蛋白可以引起EGF水平的升高。结论：在胆管癌细胞中EGF(R)信号通路和NGF-TrkA信号通路在受体和通路蛋白水平可以双向调节作用,EGF和NGF在胆管癌的发生发展中具有协同作用。第四部分NGF和TrkA在肝内胆管癌中的表达及临床病理研究目的：探讨NGF和TrkA在肝内胆管癌中表达的临床意义及预后价值,研究NGF和TrkA发挥作用的可能机制。方法：1.采用免疫组织化学的方法检测NGF和TrkA在胆管癌中的表达选择肝内胆管癌病例83例,常规免疫组织化学染色,显示NGF和TrkA在肝内胆管癌中的表达。分析NGF和TrkA和临床病理指标的关系。2.统计方法NGF和TrkA的表达和临床病理特征的关系采用卡方检验,采用Kaplan-Meier(K-M)法和COX回归对EGFR家族成员的表达与胆管癌患者预后的关系进行单因素和多因素分析。结果：肝内胆管癌中,NGF和TrkA表达与分化(P=0.024)和神经浸润(P=0.003)明显相关。NGF和TrkA的共同表达是影响肝内胆管癌患者预后的独立影响因子。结论：NGF-TrkA共同表达是肝内胆管癌的独立预后因子,提示NGF-TrkA信号通路可能成为肝内胆管癌治疗的潜在位点。