发酵法生物制氢技术利用有机废水发酵产生氢气,不单消耗了有机废物而且产生了可被利用的氢气。一直以来,研究人员采用了多种方式提高产氢效率,如优化反应器设计和操作条件、定向驯化发酵产氢微生物种群、分离高效产氢细菌、投加产氢促进剂等。氢化酶作为产氢代谢的关键功能酶,与产氢细菌的代谢末端释氢过程有着重要的联系,而成为产氢研究的热点;通过调节氢化酶的表达和酶活性,可以促进产氢细菌释放氢气。以产氢代谢功能酶为研究主体,分析厌氧发酵群落结构,揭示产氢细菌受环境因子扰动的分子机制,对提高发酵产氢系统的产氢能力,深入了解乙醇型产氢细菌的特殊代谢类型,有重要的现实意义和理论价值。本研究利用16S rRNA基因和氢化酶基因克隆文库技术比较了不同前处理方式获得的发酵产氢群落中功能菌群分布的差异。经加热处理的活性污泥呈现丁酸型发酵,主要优势菌为梭杆菌属,多个菌种同时存在;未前处理的污泥形成乙醇型发酵,哈尔滨产乙醇杆菌占绝对优势。不同氢化酶兼并引物设计时所选择的保守区域或兼顾的细菌,及目标片段长度的不同,会导致其扩增相同发酵样品结果有明显差异;设计扩增效率和准确性更高的兼并引物,或同时使用多组引物进行扩增,可以保证群落分析结果更为真实。扩增获得了哈尔滨产乙醇杆菌的[FeFe]-氢化酶基因,开放阅读框全长1743 bp,编码580个氨基酸,GenBank注册号为DQ177326。构建了该氢化酶基因异源表达载体pET28a-hydA,在大肠杆菌BL21中实现了异源超量表达,为构建基因工程菌株打下基础。在多重比对中发现了氢化酶蛋白三个新的保守区域。基于已有技术,优化了适于哈尔滨产乙醇杆菌等分泌大量胞外聚合物的细菌的总RNA提取方法。设计了哈尔滨产乙醇杆菌hydA II、AK、ADH I、ADH II、LDH基因和拜氏梭菌hydA基因的定量PCR引物,构建了包括哈尔滨产乙醇杆菌hydA I基因在内的7个功能基因的标准质粒。通过批次培养实验,考查了不同Fe²⁺、Mg²⁺、L-半胱氨酸浓度对哈尔滨产乙醇杆菌YUAN-3细胞生长和产氢能力的扰动。投加适量的三种物质可以提高细胞生长和细菌产氢能力,最适浓度分别为:FeSO₄·7H₂O 80 mg/L、MgCl₂·6H₂O 600 mg/L和L-半胱氨酸800 mg/L,与之前的研究结果基本吻合。采用荧光定量PCR技术,建立了Fe²⁺、Mg²⁺、L-半胱氨酸对菌株YUAN-3产氢能力影响和产氢功能基因表达的偶联关系。Fe²⁺和L-半胱氨酸对产氢的促进作用通过促进细胞生长和功能基因表达共同实现。Mg²⁺对YUAN-3的产氢的促进作用主要通过促进细胞生长实现,对产氢功能基因的表达有限制作用。6个功能基因的表达受三种因子的扰动各不相同。hydA I和ADH I的拷贝数始终是hydA II和ADH II这两个基因表达量的100倍左右。Fe²⁺、Mg²⁺、L-半胱氨酸对丁酸型发酵的拜氏梭菌RZF-1108和乙醇型发酵的哈尔滨产乙醇杆菌YUAN-3的细胞生长和氢气产量,及氢化酶基因表达的扰动不同。少量的Fe²⁺对两株细菌的细胞生长、产氢和基因表达都有促进作用。两株细菌对Mg²⁺都有强烈的依赖性,明显促进细胞生长和产氢,但hydA表达受到强烈抑制。L-半胱氨酸对RZF-1108的细胞生长和产氢为负影响,而对YUAN-3有促进作用;L-半胱氨酸对两株细菌的hydA表达有微弱促进作用。金属离子和L-半胱氨酸对两株细菌氢气产量的促进作用通过促进细胞生长和功能基因表达共同实现。