论文部分内容阅读
目的:建立大鼠心肌缺血预适应(IPC)模型,提取循环血中的微囊泡(IPC-MVs)。对IPC-MVs进行表型鉴定及数量分析,并探讨IPC-MVs对大鼠在体心肌缺血/再灌注(I/R)损伤的作用及与内质网应激(ERS)介导的细胞凋亡途径相关的作用机制。方法:1.大鼠在体心肌I/R损伤及IPC模型的建立健康雄性Wistar大鼠随机分为3组:假手术(Sham),I/R及IPC组。Sham组:冠状动脉左前降支(LAD)下穿线后不予结扎;I/R组:LAD下穿线行心肌缺血30min及再灌注120 min处理,对心肌造成I/R损伤;IPC组:LAD下穿线行心肌缺血5 min及再灌注5 min,循环3次的短暂I/R预处理,再行缺血30 min及再灌注120 min的I/R处理。监测Ⅱ导联心电图(ECG)、动脉收缩压(SBP)及舒张压(DBP),监测缺血期各类室性心律失常(VA)发生情况,台盼蓝/TTC染色检测心肌梗死面积。2.IPC-MVs的提取、表型鉴定及计数健康雄性Wistar大鼠随机分为2组:Sham及IPC组。Sham组:LAD下穿线后不阻断血流,旷置30 min;IPC组:LAD下穿线后行缺血5 min及再灌注5min,循环3次后自腹主动脉取血,血液经枸橼酸钠抗凝并经两步离心得到无血小板血浆(PFP)。取90μL PFP运用流式细胞术对MVs进行表型鉴定及计数。剩余PFP经超速离心得到IPC-MVs,用于后期处理大鼠。在PFP中分别加入血小板、内皮细胞、白细胞及红细胞的表面标志物CD61,CD144,CD45及Erythroid Cells单抗,并加入1,2μm的标准微球流式上机检测。3.IPC-MVs对I/R大鼠MAP,HR,ST-段水平及心肌组织坏死的影响健康雄性Wistar大鼠随机分为3组:Sham,I/R及IPC-MVs+I/R组。Sham组:LAD下穿线后不阻断血流,旷置150 min,于旷置25 min自股静脉注射相应体积的生理盐水(NS);I/R组:给予I/R处理,于缺血25 min注射相应体积的NS;IPC-MVs+I/R组:给予I/R处理,于缺血25 min注射依蛋白定量计算后的IPC-MVs 7 mg/kg。监测ECG,SBP及DBP,记录缺血期VA发生情况,微板法检测血清乳酸脱氢酶(LDH)活力,台盼蓝/TTC染色测定心肌梗死面积,苏木素-伊红(HE)染色观察心肌组织形态改变。4.ipc-mvs对i/r大鼠心肌细胞凋亡的影响实验分组同方法3。原位末端标记法(tunel)检测心肌细胞凋亡指数(ai),微量酶标法检测心肌组织caspase3活力。5.ipc-mvs对i/r大鼠心肌组织中内质网相关蛋白表达的影响实验分组同方法3。微量酶标法检测心肌组织caspase12活力,westernblot法检测心肌组织葡萄糖调控蛋白78(grp78)及转录因子c/ebp同源蛋白(chop)的表达水平。结果:1.成功建立大鼠在体心肌i/r损伤及ipc模型大鼠心肌i/r损伤模型建立成功。与缺血前相比,缺血立即平均动脉压(map)显著下降且st-段显著抬高(56.62±9.10mmhgvs85.86±10.71mmhg;0.322±0.034mvvs0.012±0.031mv,p<0.001),至缺血30min末,st-段抬高至峰值(0.500±0.060mv)。心率(hr)于i/r期间进行性下降,至再灌注120min末,hr较缺血前相比明显降低(285±22次/minvs464±20次/min,p<0.001)。缺血期室早(vpc)首次出现时间早(6.54±1.11min),室早个数为205±33;室速(vt)首次出现时间早(8.36±1.28min),持续时间长(0.68±0.41min),二者发生率均为100%;室颤(vf)发生率为75%。心肌组织梗死区/危险区(is/aar)为43.04±6.26%。与i/r组相比,ipc组缺血期末st-段抬高幅度显著降低(0.403±0.043mvvs0.500±0.060mv,p<0.01),再灌注末hr显著恢复(327±11次/minvs285±22次/min,p<0.01)。缺血期vpc(16.49±9.49minvs6.54±1.11min,p<0.01)及vt(15.23±2.40minvs8.36±1.28min,p<0.001)首次出现时间明显推迟,vpc个数明显减少(15±23vs205±33,p<0.001),vt持续时间明显缩短(0.12±0.18minvs0.68±0.41min,p<0.05),vt及vf的发生率降低(37.5%vs100%;0%vs75%,p<0.01);心肌梗死面积明显缩小(18.76±4.18%vs43.04±6.26%,p<0.001)。大鼠心肌ipc模型建立成功。2.ipc-mvs的提取、表型鉴定及计数大鼠循环血经2,600g,15min和10,000g,5min两步离心得到pfp。采用33,000rpm,148min,4℃离心得到ipc-mvs。流式检测的1μm以下且对应荧光抗体呈阳性的微粒即定义为不同细胞来源的ipc-mvs。与sham组相比,ipc-mvs中血小板来源mvs(pmvs,1094±181events/μlvs719±115events/μl,p<0.05)、内皮细胞来源mvs(emvs,475±42events/μlvs388±34events/μl,p<0.05)和红细胞来源mvs(rmvs,1539±212events/μlvs1200±171events/μl,p<0.05)的数量均显著增加,但mvs总数(4380±745events/μlvs3453±307events/μl)和白细胞来源mvs(lmvs,117±20events/μlvs91±11events/μl)的数量无显著性变化。3.ipc-mvs改善i/r大鼠hr,st-段水平并减轻心肌组织坏死程度i/r及ipc-mvs+i/r组全程map变化趋势一致,组间无显著性差别。全程hr变化趋势一致,至再灌注120min末,ipc-mvs+i/r组hr较i/r组明显恢复(331±9次/minvs305±13次/min,p<0.01);两组缺血期st-段均进行性抬高,再灌注后逐渐回落。至再灌注120min末,与i/r组相比,ipc-mvs+i/r组st-段水平显著降低(0.043±0.027mvvs0.097±0.056mv,p<0.05);组间缺血期va发生情况无显著性差异。与sham组相比,i/r及ipc-mvs+i/r组血清ldh活力于缺血30min及再灌注120min均显著升高(p<0.001),与i/r组相比,ipc-mvs+i/r组ldh活力于再灌注120min明显下降(10.975±1.005u/mlvs12.910±1.111u/ml,p<0.01)。ipc-mvs+i/r组心肌梗死面积较i/r组显著缩小(29.63±3.90%vs40.50±2.54%,p<0.001),提示心肌组织损伤程度明显减轻。4.ipc-mvs抑制i/r诱发的大鼠心肌细胞凋亡与i/r组相比,ipc-mvs+i/r组心肌细胞ai显著降低(22.98±1.61%vs34.14±1.26%,p<0.001)。心肌组织caspase3活力较i/r组显著下降(54.35±3.75u/μgvs71.23±4.35u/μg,p<0.001)。5.ipc-mvs通过抑制ers抗i/r大鼠心肌损伤ipc-mvs+i/r组心肌组织caspase12活力较i/r组显著下降43%(p<0.05)。westernblot检测结果显示,与i/r组相比,ipc-mvs+i/r组grp78及chop的蛋白表达量均显著下降(0.47±0.07%vs0.77±0.10%,p<0.001;0.68±0.07%vs0.89±0.10%,p<0.01)。结论:1.成功建立大鼠在体心肌i/r损伤及ipc模型。2.流式检测证实粒径小于1μm的微粒即为ipc-mvs,且来源于血小板、内皮细胞、白细胞和红细胞。其中pmvs,emvs及rmvs的数量显著增加。3.静脉注射7mg/kg的ipc-mvs可显著恢复i/r大鼠再灌注末hr,降低再灌注末st-段水平和血清ldh活力,缩小心肌梗死面积,减轻组织坏死程度。4.静脉注射7mg/kg的ipc-mvs可明显减轻i/r所致的大鼠心肌细胞凋亡,表现为降低心肌细胞AI和Caspase 3活力。5.IPC-MVs显著降低I/R大鼠心肌组织内Caspase 12活力,下调GRP78及CHOP蛋白的表达,其产生的心肌保护效应是通过抑制ERS介导的细胞凋亡途径实现的。