MicroRNA是近年来发现的一类高度保守的，存在于动植物以及病毒中的长约22个核苷酸的非编码小分子RNA，miRNA主要通过与靶标基因3′非翻译区（3′UTR）的完全或不完全配对，降解靶标基因mRNA或抑制其翻译，从而广泛参与调控个体生长发育、细胞凋亡、增殖及分化等生命活动。越来越多的证据表明，miRNA的表达紊乱与肿瘤的发生发展密切相关。肝癌是发病率和致死率都很高的恶性肿瘤之一，5年生存率不到40%，严重危害人们的生命和健康。因此，揭示肝癌发生发展分子机制的研究对于有效地预防肝癌，提高肝癌的治疗效果有重要意义。近几年科学家发现了许多在HCC中起重要作用的microRNA并阐述了其作用机制，比如miR-221, miR-222,miR-21, miR-122等以及许多与肿瘤分化，肿瘤转移和预后等临床指征相关microRNA，丰富了肝癌发病机制的理论认识。人和动物的肝脏都具有极强的调节自身生长和大小的能力，肝切除后肝脏即进入增殖状态，引起一系列肝再生因子水平的变化，比如：肝细胞生长因子（HGF HepatocyteGrowth Factor），这些因子一方面使肝再生精确、有序地进行，另一方面也有可能影响肿瘤细胞所处的环境，导致肿瘤的复发。因此，肝再生和肝癌之间有着非常密切的联系。本研究组用microRNA芯片筛选小鼠肝再生早期发生变化的microRNA时，筛选到Mmu-miR-376b在肝再生早期表达是下调的，又因为肝再生早期与肝癌发生过程中有许多共有的调节因子，因此我们试想miR-376在肝癌中的表达是否发生异常，而miR-376的异常表达与肝癌的发生发展又有怎样的关系。Hsa-miR-376b与Hsa-miR-376a之间有很强的同源性，因此我检测了miR-376a和miR-376b在肝癌组织中的表达变化，并发现miR-376a在肝癌组织中的变化较miR-376b明显，因此我们以miR-376a为研究对象，研究其在肝癌中的作用机制。目前已经有几篇文章报道了miR-376在人肝内胆管癌，上皮卵巢癌等肿瘤中表达是下调的，而对于miR-376功能的研究尚知之甚少，并且miR-376在肝细胞癌中的作用及其机制研究未见诸报道。本论文针对miR-376a研究其在肝癌组织中的表达规律并进一步探讨其功能及分子机制，为更好地阐明肝癌发生发展的分子机制并探索肝癌潜在的治疗靶点提供实验依据。一miR-376a在肝癌组织中的表达及其生物学功能的研究我们在肝癌标本中检测了miR-376b和miR-376a的表达水平，发现miR-376a的表达变化趋势更明显，在大多数癌组织中的表达低于其癌旁组织，说明miR-376a表达水平的降低是肝癌发生发展过程中的一个高频事件。因此，本文以miR-376a为研究对象研究其生物学功能以及临床意义。通过对miR-376a在肝癌组织及癌旁组织中的的表达变化与临床指征进行关联，卡方检验结果提示, miR-376a的表达变化与血清甲胎蛋白的水平有关，即血清中甲胎蛋白高的患者其癌组织中的miR-376a的表达水平也较高，由于甲胎蛋白是肝癌诊断的标志物，提示miR-376a可能辅助甲胎蛋白作为肝癌诊断潜在的标志物。为了明确miR-376a在肝癌发生中的生物学功能，我们用miR-376a mimics处理肝癌细胞系（Huh7和HepG2），通过MTT实验检测其细胞的增殖能力，通过AV-FITC/PI染色后流式细胞术检测其细胞凋亡率，并将miR-376基因克隆进pcDNA3.1质粒中，并筛选了稳定表达miR-376的Huh7细胞株，并以该细胞株荷瘤裸鼠，检测裸鼠的成瘤率。结果显示，miR-376a抑制了细胞增殖，促进了细胞凋亡，并且抑制了Huh7细胞在裸鼠体内的成瘤率。二miR-376a下游调控机制的研究为了探讨miR-376a的抑癌机制，我们通过Targetscan软件预测了miR-376a的候选靶基因，得到了大约220个候选靶基因。为了从中筛选到起关键作用的靶基因，我们进一步用博奥公司的MAS软件对候选靶基因进行了信号通路分析以及GO功能分析，Pathway分析结果显示，候选靶基因相互作用构成了一个复杂的相互作用网络，而PIK3R1处于这个网络的节点位置，即Hub基因。文献提示，Hub基因对于维持网络的稳定起着关键的作用，并且越来越多的研究表明，microRNA倾向于调控Hub基因。而qRT-PCR和Western Blotting实验结果显示，miR-376a降低了PIK3R1的表达水平。并且，荧光素酶报告基因实验证实，PIK3R1是受miR-376a直接调控的靶基因。另外，我们通过WB的方法检测了肝癌组织中p85α(PIK3R1)的表达，发现p85α在肝癌组织中是表达上调的，与miR-376a的表达趋势是相反的，并且我们做了统计分析，两者存在负相关趋势，说明肝癌组织中p85α的表达上调与miR-376a的表达下调有关。为了探讨PIK3R1的生物学功能，我们通过RNAi和过表达的方法处理Huh7细胞，然后通过MTT实验和AV-FITC/PI染色的方法分别检测了细胞增殖的变化和细胞凋亡的变化。结果显示Huh7细胞中的PIK3R1被有效干扰后，细胞增殖率降低，细胞凋亡率升高，而PIK3R1过表达后，细胞凋亡率降低。说明PIK3R1是抑制细胞凋亡，促进细胞增殖的作用。这与文献报道的是一致的。另有文献报道, miR-29可以通过靶向抑制PIK3R1而激活p53的表达，那么我们猜想miR-376a既然可以靶向抑制PIK3R1的表达，那么p53的表达水平是否变化了呢，我们发现miR-376a mimics处理Huh7细胞后p53表达升高了，并且Huh7细胞中PIK3R1被干扰后，p53表达也升高了。因此，我们推测, miR-376a可通过抑制PIK3R1的表达而激活p53的表达。三miR-376a上游表达调控机制的研究有文献提示,在人上皮卵巢癌细胞系（EOC）中miR-376a所在基因簇的表达水平受表观遗传修饰的调节。为了探讨肝细胞中miR-376a基因簇是否受表观遗传修饰的控制，我们用DNA甲基化酶抑制剂5-Aza-CdR和组蛋白去乙酰化酶抑制剂PBA处理大鼠正常肝细胞BRL-3A和Huh7细胞。结果显示，与对照组相比，这两个细胞株中的miR-376a表达都升高了，说明是表观遗传修饰的变化激活了miR-376a的表达。另有报道称microRNA与表观遗传修饰相互影响共同参与癌症的发生发展，那么在miR-376a的候选靶基因中是否有与表观遗传相关的基因呢，通过MAS软件对靶基因进行GO分析，发现了HDAC9这个靶基因，随即我们通过RT-PCR和WB验证，证实了HDAC9是受miR-376a调控的靶基因。已知HDAC9抑制MEF2介导的基因转录，且有文献证实MEF2是调控miR-376a所在基因簇的转录因子。因此我们分别将HDAC9和MEF2干扰掉，再检测miR-376a的表达，结果显示HDAC9被干扰后miR-376a的表达上调了，说明HDAC9是抑制miR-376a表达的；而MEF2被干扰后，miR-376a表达下调了,说明MEF2正向调控miR-376a的表达。以上结果表明，miR-376a的表达受表观遗传修饰的调节，其靶基因HDAC9又参与了miR-376a的表达调控。