灰葡萄孢BcKMO基因与信号途径关键基因的关系研究

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实验室前期通过筛选灰葡萄孢的T-DNA插入突变体库,获得了1株不产生菌核的突变体BCG183,明确了其突变基因为BcKMO,该基因编码犬尿氨酸单加氧酶(kynurenine3-monooxygenase,KMO)。通过构建BcKMO基因的回复突变体BCG183/BcKMO,明确了BcKMO基因正调控病菌的生长、发育,负调控病菌的致病力;确定了BcKMO基因通过影响病菌的胞壁降解酶活性、毒素活性、产酸能力、致病相关基因及信号途径基因的表达来调控病菌的致病力。本研究利用外源蛋白重组表达技术获得了纯化的BcKMO蛋白,并确定了其具有犬尿氨酸单加氧酶活性;通过检测BcKMO基因与cAMP、MAPK途径关键基因的表达规律,分析BcKMO基因与cAMP、MAPK途径关键基因的关系;通过检测BcKMO基因突变对cAMP、MAPK途径关键基因表达的影响,以及cAMP、MAPK途径关键基因突变对BcKMO基因表达的影响,进一步分析BcKMO基因与cAMP、MAPK途径关键基因的关系。主要研究结果如下:  1.利用外源蛋白重组表达技术,获得了纯化的BcKMO蛋白;利用酶联免疫分析技术,确定了纯化的BcKMO蛋白具有犬尿氨酸单加氧酶活性,其酶活力为2.56U/L。  2.利用Real-time PCR技术,检测病菌不同发育阶段、不同组织部位及不同培养条件下BcKMO基因和cAMP、MAPK途径关键基因的表达水平。结果发现,BcKMO基因与cAMP途径关键基因pka1、bcg2、bcg3和MAPK途径关键基因bmp3的表达规律基本一致,均是在7d的菌丝和菌核中表达水平较高;BcKMO基因和cAMP、MAPK途径关键基因均是在含果糖培养基上培养的病菌中表达水平较高;在不同培养条件培养的病菌中,BcKMO基因的表达规律与bmp1基因基本一致。推测,BcKMO基因与cAMP途径关键基因pka1、bcg2、bcg3和MAPK途径关键基因bmp1、bmp3间的关系较为密切。  3.利用Real-time PCR技术,对BC22、BCG183和BCG183/BcKMO菌株中BcKMO基因、cAMP关键基因(pka1、pka2、pkaR、bcg2、bcg3)和MAPK途径关键基因(bmp1、bmp3)的表达水平进行检测。结果发现,在BcKMO基因的T-DNA插入突变体BCG183中cAMP途径关键基因pka1、pka2、pkaR、bcg2、bcg3和MAPK途径关键基因bmp1的表达水平均明显高于野生型和回复突变体,MAPK途径关键基因bmp3的表达水平明显低于野生型和回复突变体,表明,BcKMO基因负调控cAMP途径关键基因pka1、pka2、pkaR、bcg2、bcg3和MAPK途径关键基因bmp1的表达,正调控MAPK途径关键基因bmp3的表达。  4.利用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术,获得了cAMP途径关键基因(pka1、pka2、pkaR、bcg2、bcg3)和MAPK途径关键基因(bmp1、bmp3)的RNAi突变体。采用Real-time PCR技术,检测各基因RNAi突变体中BcKMO基因的表达水平。结果发现,cAMP途径关键基因pka1、bcg2和MAPK途径关键基因bmp1的RNAi突变体中BcKMO基因表达水平明显高于野生型,而cAMP途径关键基因pka2、pkaR、bcg3和MAPK途径关键基因bmp3基因的RNAi突变体中BcKMO基因表达水平明显低于野生型,表明cAMP途径关键基因pka1、bcg2和MAPK途径关键基因bmp1负调控BcKMO基因的表达,而cAMP途径关键基因pka2、pkaR、bcg3和MAPK途径关键基因bmp3正调控BcKMO基因的表达。
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